本文關(guān)鍵詞：microRNA-155靶向SOCS1基因在新生隱球菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【研究背景及目的】新生隱球菌是一種臨床上主要導(dǎo)致免疫抑制患者產(chǎn)生隱球菌病的重要致病真菌。新生隱球菌的典型感染途徑為把干燥的擔(dān)孢子或酵母吸入肺泡中,在免疫正常人則引起輕微感染或無癥狀感染。此外新生隱球菌有顯著嗜神經(jīng)性,其可傳播至中樞神經(jīng)引起可威脅生命的隱球菌性腦膜腦炎,因此,肺內(nèi)吞噬細(xì)胞主要包括巨噬細(xì)胞,在決定能否阻止新生隱球菌傳播到中樞,是否引起威脅生命的腦膜腦炎的過程中起重要作用。microRNA(miRNA)是由19-24個核苷酸組成的非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)著多個靶基因的表達(dá)。其中miR-155在炎癥和腫瘤方面均參與調(diào)節(jié)作用。它由眾多的炎癥介質(zhì)比如TNF-a和脂多糖等通過固有免疫調(diào)節(jié)。miR-155在多種被激活的免疫細(xì)胞中均有表達(dá),包括在決定新生隱球菌能否傳播到中樞的肺泡巨噬細(xì)胞中也有表達(dá),及其他的免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及DC細(xì)胞,已知的miR-155的眾多靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包括促凋亡和抑炎蛋白,如Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白,Ik B激酶和SOCS1。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子包括CIS及SOCS1-7,是一類免疫抑制分子家族,它們均由細(xì)胞產(chǎn)生并能夠反饋性地阻斷細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)過程的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,其可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子,在多種人體炎性疾病過程中均有參與調(diào)控。其中SOCS1,又名SSI-1(STAT-induced STAT inhibitor-1),其可由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)而產(chǎn)生,又可反過來抑制眾多促炎癥因子如TNF-α,IL-6,IFN-γ等,是JAK/STAT通路上重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因素。既往的研究發(fā)現(xiàn)在脂多糖以及病毒誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中,均可觀測到miR-155的上調(diào),并且能觀測到抑制其靶基因SOCS1。在我們所關(guān)注的新生隱球菌感染的炎癥反應(yīng)中,miR-155是否影響SOCS1,是否影響炎癥因子如TNF-α,IL-6的調(diào)節(jié)仍不明確,因此在本研究中,我們用熱滅活的新生隱球菌刺激單核巨噬細(xì)胞RAW264.7,觀察miR-155靶向SOCS1的表達(dá)變化及調(diào)控規(guī)律,分析在新生隱球菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中是否也存在miR-155靶向SOCS1的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,探索其是否也在隱球菌病的發(fā)病機(jī)制中承擔(dān)一定的作用。第一部分:新生隱球菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平、TNF-α、IL-6表達(dá)水平的檢測。為了明確在新生隱球菌刺激下的巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-155水平是否對炎癥因子有影響,我們用新生隱球菌(標(biāo)準(zhǔn)株WM148)與巨噬細(xì)胞(RAW264.7細(xì)胞系)共孵育,分別在第0、3、6、9、12小時后收集細(xì)胞及其上清液,通過實時熒光定量PCR(q RT-PCR)檢測巨噬細(xì)胞miR-155,使用ELISA法檢測上清液中炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)量,并觀察其變化規(guī)律。結(jié)果:在新生隱球菌與巨噬細(xì)胞共孵育0、3、6、9、12小時后,測得miR-155的表達(dá)量明顯升高(P0.05),而同時細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)量呈時間依賴表達(dá)增加,然而后期增幅并不明顯。第二部分:新生隱球菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中SOCS1基因和蛋白層面表達(dá)的檢測miR-155重要的靶基因為SOCS1,為了明確在新生隱球菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中,是否SOCS1確實有調(diào)控作用,我們使新生隱球菌與巨噬細(xì)胞共孵育,分別在第0、3、6、9、12小時后收集細(xì)胞,通過實時熒光定量PCR檢測巨噬細(xì)胞SOCS1的基因表達(dá)量,Western blot檢測SOCS1蛋白的表達(dá)量。結(jié)果:新生隱球菌與巨噬細(xì)胞共孵育0、3、6、9、12小時后,SOCS1基因表達(dá)量增加明顯(P0.05),但SOCS1蛋白表達(dá)不明顯。第三部分:通過轉(zhuǎn)染抑制巨噬細(xì)胞miR-155后SOCS1表達(dá)的影響為進(jìn)一步探討在新生隱球菌作用下巨噬細(xì)胞中miR-155對其靶基因SOCS1的影響,我們給RAW264.7細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-155的siRNA以抑制miR-155表達(dá)后,再一次新生隱球菌共孵育誘導(dǎo),時間設(shè)定分別為第0、3、9小時,通過實時熒光定量PCR檢測巨噬細(xì)胞SOCS1的表達(dá)量,Western blot檢測SOCS1蛋白的表達(dá)量。結(jié)果:抑制miR-155表達(dá)后的巨噬細(xì)胞與新生隱球菌共孵育誘導(dǎo)測得在第3、9小時SOCS1的基因和SOCS1蛋白的表達(dá)都有顯著增加,同抑制miR-155表達(dá)后共孵育0小時比較有統(tǒng)計學(xué)意義。【結(jié)論】我們研究結(jié)果顯示新生隱球菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后,會刺激炎癥因子如TNF-α、IL-6等的釋放,并會觸發(fā)機(jī)體一系列的負(fù)反饋機(jī)制的激活。在炎癥因子的刺激下SOCS1基因的表達(dá)已被激活,但我們觀察到SOCS1蛋白的表達(dá)沒有明顯的增加,表明在某些信號通路上有抑制SOCS1激活基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制的存在。正是由于這種機(jī)制的存在,有效避免了在炎癥表達(dá)的初期,負(fù)反饋機(jī)制過度的抑制抗炎因子產(chǎn)生,而不能發(fā)揮正常適度的巨噬細(xì)胞抵抗病原菌的作用。本實驗通過抑制miR-155的基因表達(dá),觀察miR-155對靶基因SOCS1的調(diào)控作用。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA后,抑制miR-155的表達(dá),在新生隱球菌誘導(dǎo)3 h、9 h后,SOCS1基因的表達(dá)增加,同時SOCS1蛋白有相應(yīng)的增加,結(jié)果表明miR-155表達(dá)抑制以后,部分解除對SOCS1基因轉(zhuǎn)錄水平的抑制。說明miR-155對SOCS1確實存在一定程度的抑制作用。綜上所述,我們實驗表明在新生隱球菌被吸入肺泡后在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的早期,在炎癥因子TNF-a、IL-6的誘導(dǎo)下,SOCS-1產(chǎn)生并對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)起到負(fù)反饋調(diào)節(jié),以調(diào)控適度的免疫反應(yīng)。而SOCS-1是miR-155的靶基因之一,本研究表明,在新生隱球菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中,SOCS1的細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制的作用發(fā)揮受到miR-155的負(fù)向調(diào)控。有效的避免了在炎癥表達(dá)的初期,負(fù)反饋機(jī)制過度的抑制抗炎因子產(chǎn)生,而不能發(fā)揮正常適度的巨噬細(xì)胞抵抗病原菌的作用。正是這些環(huán)環(huán)相扣的調(diào)節(jié)機(jī)制使得免疫反應(yīng)能適度地、正常地發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：微小RNA-155(miR-155) 新生隱球菌 RAW264.7 SOCS1 IL-6 TNF-α
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R379.5
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 中英文縮略詞對照表13-14
• 前言14-18
• 第一部分：新生隱球菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平、TNF-α、IL-6表達(dá)水平的檢測18-28
• 一、實驗材料19-22
• 二、實驗方法22-25
• 三、統(tǒng)計學(xué)處理25
• 四、結(jié)果25-26
• 五、討論26-28
• 第二部分：新生隱球菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中SOCS1基因和蛋白層面表達(dá)的檢測28-34
• 一、實驗材料28-29
• 二、實驗方法29-30
• 三、統(tǒng)計學(xué)處理30
• 四、結(jié)果30-31
• 五、討論31-34
• 第三部分：通過轉(zhuǎn)染抑制巨噬細(xì)胞miR-155 后SOCS1表達(dá)的影響34-40
• 一、實驗材料35
• 二、實驗方法35
• 三、統(tǒng)計學(xué)處理35
• 四、結(jié)果35-37
• 五、討論37-40
• 全文總結(jié)40-41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 文獻(xiàn)綜述(Literature Review) SOCS1蛋白在免疫系統(tǒng)中的作用及進(jìn)展45-55
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 碩士期間發(fā)表文章55-56
• 致謝56

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