目的·在人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells,hESCs）中構(gòu)建基于CRISPR干擾系統(tǒng)的多基因同時(shí)抑制系統(tǒng),作為研究家族基因功能和構(gòu)建多基因疾病模型的工具。方法·通過(guò)Golden Gate克隆法在hESCs中建立受強(qiáng)力霉素（doxycycline,Dox）調(diào)控的多基因CRISPR干擾系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要由2個(gè)質(zhì)粒組成:1個(gè)質(zhì)粒在Dox調(diào)控下融合表達(dá)核酸酶失活的CRISPR相關(guān)蛋白9（nucleasedeactivated CRISPR-associated protein 9,dCas9）和Krüppel相關(guān)盒（Krüppel-associated box,KRAB）抑制結(jié)構(gòu)域（dCas9-KRAB）,另1個(gè)質(zhì)粒可同時(shí)表達(dá)8個(gè)獨(dú)立的導(dǎo)向RNA（guide RNA,gRNA）來(lái)分別引導(dǎo)dCas9-KRAB蛋白到基因組特定位點(diǎn)抑制轉(zhuǎn)錄起始或延伸。以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR,確定2個(gè)質(zhì)粒是否整合至細(xì)胞基因組,并通過(guò)Western blotting確定細(xì)胞在Dox誘導(dǎo)下是否可表達(dá)dCas9-KRAB蛋白。結(jié)果·使用這種可調(diào)控的多基因CRISPR干擾系統(tǒng),可在Do... 

【文章來(lái)源】：上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2019,39(05)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

通過(guò)Dox誘導(dǎo)抑制多基因的表達(dá)導(dǎo)致hESCs分化Fig4Dox-inducedinhibitiono注：熒光實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)idCas9-M8細(xì)胞在Dox處理5d后多能性相關(guān)的基因（A）、滋養(yǎng)層相關(guān)基因（B）以及內(nèi)胚層（C）、中胚層（D）


本文編號(hào)：3360708