本文關(guān)鍵詞：ZFP580在TGF-β1抗化學(xué)性缺氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:缺氧是許多臨床常見(jiàn)疾病的共同病理生理過(guò)程,當(dāng)機(jī)體尤其是心臟和大腦等重要器官遭受?chē)?yán)重缺氧時(shí)甚至?xí)䦟?dǎo)致死亡。氯化鈷作為一個(gè)廣為人知的缺氧模擬劑,它可以通過(guò)增加活性氧(Reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生、降低細(xì)胞活力、改變線粒體膜電位、激活Caspase-3和誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生缺氧/缺血性應(yīng)答。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞外分泌型信號(hào)多肽,可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、黏附、移行及凋亡,在生物體的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。TGF-β1在心臟保護(hù)中的作用也一直是研究的熱點(diǎn),諸多報(bào)道表明其在心肌細(xì)胞損傷中通常扮演抗凋亡的角色。大鼠ZFP580是由本組克隆的一種C2H2型鋅指蛋白,前期研究表明TGF-β1可誘導(dǎo)其表達(dá),且ZFP580在缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷中具有促進(jìn)細(xì)胞存活及抗凋亡等細(xì)胞保護(hù)作用。然而,ZFP580在H9c2心肌細(xì)胞缺氧損傷中是否具有類(lèi)似作用及具體機(jī)制,以及是否受到TGF-β1的調(diào)控仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)氯化鈷處理H9c2心肌細(xì)胞建立化學(xué)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型,探究ZFP580在TGF-β1抗H9c2心肌細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)效應(yīng)中的作用及具體機(jī)制。方法:MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率;Real time-PCR測(cè)定ZFP580和HIF-1α的m RNA表達(dá)水平;Western-blot檢測(cè)ZFP580、HIF-1α、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Bax、Bcl-2和Active Caspase-3的蛋白表達(dá);Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;DCFH-DA檢測(cè)活性氧生成;使用SB431542阻滯劑及慢病毒干擾技術(shù)后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果:1氯化鈷處理降低細(xì)胞存活率并上調(diào)ZFP580和HIF-1α的表達(dá)氯化鈷可呈時(shí)間和劑量依賴方式降低細(xì)胞存活率。給予H9c2心肌細(xì)胞不同劑量的氯化鈷(400、600、800、1000μM)處理24 h,細(xì)胞存活率隨著氯化鈷濃度的升高而降低,結(jié)果顯示600μM氯化鈷處理24 h時(shí)細(xì)胞存活率接近50%。然后使用600μM氯化鈷分別處理細(xì)胞0、4、8、12、16、20和24 h,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比在8、12、16、20和24 h顯著降低(P0.05)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot的結(jié)果顯示,氯化鈷能在m RNA和蛋白水平促進(jìn)ZFP580的表達(dá),其m RNA表達(dá)高峰在12 h早于蛋白質(zhì)表達(dá)水平的峰值16 h。而HIF-1α蛋白迅速積累且表達(dá)峰值在12 h,但在m RNA水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)HIF-1α的顯著改變。2 TGF-β1減弱氯化鈷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性并上調(diào)ZFP580蛋白的表達(dá)為了進(jìn)一步探討在缺氧狀態(tài)下TGF-β1的作用,在暴露于氯化鈷相應(yīng)時(shí)間前給予TGF-β1預(yù)處理。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與各自相對(duì)應(yīng)的單純?nèi)毖踅M相比,TGF-β1預(yù)處理16 h和24 h明顯減弱氯化鈷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性,提高細(xì)胞存活率達(dá)到約10%(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示常氧條件下TGF-β1刺激8、16和24 h后ZFP580的表達(dá)顯著升高。同時(shí),我們注意到暴露氯化鈷處理前使用TGF-β1預(yù)處理也可以誘導(dǎo)ZFP580蛋白表達(dá)的上調(diào)。與各自相對(duì)應(yīng)的單純?nèi)毖踅M相比,TGF-β1預(yù)處理8 h和24 h處ZFP580的表達(dá)上調(diào)明顯改變,尤其是在24 h時(shí)間點(diǎn)處(P0.05)。然而,在16 h時(shí)間點(diǎn)上,TGF-β1預(yù)處理的細(xì)胞與單純?nèi)毖醯募?xì)胞之間沒(méi)有觀察到ZFP580表達(dá)的差別。3抑制Smad2/3的活化減弱ZFP580蛋白表達(dá)和TGF-β1介導(dǎo)的抗氯化鈷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用使用公認(rèn)的TβR1-Smad2/3選擇性抑制劑SB431542給予H9c2心肌細(xì)胞預(yù)處理,然后在暴露于氯化鈷前予以TGF-β1刺激。結(jié)果表明SB431542能部分阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的ZFP580表達(dá)上調(diào)。另一方面,流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明,與單純?nèi)毖踅M相比,TGF-β1預(yù)處理可以顯著降低的凋亡細(xì)胞的比例(P0.05);與DMSO對(duì)照組相比,抑制Smad2/3的活化會(huì)使凋亡細(xì)胞的比例增加(P0.05)。4 ZFP580在TGF-β1抗氯化鈷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和ROS生成中的作用為了探討ZFP580在抗氯化鈷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡TGF-β1/Smad2/3信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的作用,我們通過(guò)轉(zhuǎn)染ZFP580干擾慢病毒下調(diào)ZFP580的表達(dá),然后在暴露于氯化鈷前對(duì)細(xì)胞使用或不使用TGF-β1預(yù)處理。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明,RNA干擾ZFP580組與陰性對(duì)照組相比,細(xì)胞凋亡比例顯著增加(P0.05);當(dāng)轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞在暴露于氯化鈷之前預(yù)先用TGF-β1處理,RNA干擾ZFP580抑制其表達(dá)會(huì)明顯減弱TGF-β1的抗凋亡效果,凋亡細(xì)胞的比例顯著增加(P0.05)。共聚焦顯微鏡和酶標(biāo)儀的結(jié)果表明,缺氧條件下RNAi-ZFP580組與陰性對(duì)照組相比,細(xì)胞的活性氧顯著積累(P0.05)。同時(shí)TGF-β1預(yù)處理可以減少氯化鈷誘導(dǎo)的ROS生成。5 ZFP580通過(guò)抑制線粒體凋亡途徑參與了TGF-β1的抗凋亡作用我們進(jìn)一步探討了ZFP580通過(guò)TGF-β1/Smad2/3信號(hào)傳導(dǎo)途徑抗氯化鈷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。蛋白印跡的結(jié)果表明細(xì)胞預(yù)處理TGF-β1后,促凋亡分子Bax和活化的Caspase-3表達(dá)以及Bax/Bcl-2比率顯著降低,抗細(xì)胞凋亡的分子Bcl-2表達(dá)顯著增高(P0.05)。同時(shí),通過(guò)RNA干擾ZFP580抑制其表達(dá)后,TGF-β1的抗凋亡效果會(huì)被明顯減弱,Bax/Bcl-2比率和活性Caspase-3的表達(dá)均顯著增加(P0.05)。結(jié)論:本研究中提供的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,ZFP580可以作為缺氧環(huán)境下的新型調(diào)節(jié)分子。我們證實(shí),ZFP580通過(guò)抑制線粒體凋亡途徑在TGF-β1介導(dǎo)的抗化學(xué)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要的抗凋亡保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：氯化鈷 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 鋅指蛋白580 缺氧 凋亡
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R363
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫(xiě)11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-23
• 結(jié)果23-26
• 附圖26-33
• 附表33-36
• 討論36-38
• 結(jié)論38
• 參考文獻(xiàn)38-43
• 綜述 HIF-1α 在心肌缺氧缺血損傷中的作用機(jī)制及靶向治療研究43-54
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 致謝54-56
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷56

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 羅玉玉;鋅指轉(zhuǎn)錄因子ZNF580相互作用蛋白的篩選與鑒定[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

2 孟祥艷;ZFP580參與間歇低氧抗大鼠心肌缺血—再灌注損傷的機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 侯兵;鋅指基因ZNF580過(guò)表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

2 韋淑萍;ZNF580在S1P誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖中的作用[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

3 趙瑛;ZNF580在TGF-β誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)eNOS中的作用研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：ZFP580在TGF-β1抗化學(xué)性缺氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：333943