本文關(guān)鍵詞：豬呼吸道上皮細(xì)胞體外分化模型的建立及其應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 目前體外分化的人呼吸道上皮細(xì)胞(Human airway epithelial cell, HAEC)已被廣泛應(yīng)用于新發(fā)呼吸道病毒的鑒定、宿主與呼吸道病原體間相互作用和呼吸系統(tǒng)疾病的研究中。豬是許多人呼吸道病毒感染的天然宿主,在肺生理學(xué)、呼吸道形態(tài)學(xué)和呼吸道細(xì)胞類(lèi)型以及受體分布都與人類(lèi)有相似之處,因此豬可作為研究呼吸道病毒感染和呼吸系統(tǒng)疾病藥物篩選的理想模型。目的構(gòu)建豬呼吸道上皮細(xì)胞(Porcine airway epithelial cell, PAEC)體外分化模型,鑒定其形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征及其在轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因方面的應(yīng)用。方法本研究采用蛋白酶低溫消化分離豬氣管和支氣管上皮細(xì)胞,接種至I/III型膠原蛋白包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,使用添加多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)。細(xì)胞接種至IV型膠原蛋白包被的半透膜支持物上,采用氣液界面培養(yǎng)法進(jìn)行豬呼吸道上皮細(xì)胞的體外分化培養(yǎng)。采用掃描電鏡法、電生理和免疫組化等方法檢測(cè)和鑒定培養(yǎng)物的細(xì)胞組成和形態(tài)學(xué)特性以及其表面典型的細(xì)胞標(biāo)志蛋白。腺相關(guān)病毒(Adenoassociated virus, AAV)具有免疫原性低和可介導(dǎo)外源基因長(zhǎng)期表達(dá)的特性,在基因治療領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用空間。本實(shí)驗(yàn)研究中將pXX680, pXR6, PSC-GFP三種質(zhì)粒按照6：5：3的比例轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,培養(yǎng)48h后,收獲含重組腺相關(guān)病毒rAAV6-GFP的293T細(xì)胞。利用兩步氯化銫梯度離心純化重組rAAV6-GFP病毒并感染分化成熟的豬呼吸道上皮細(xì)胞,研究AAV6在該模型上的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,驗(yàn)證AAV6能否有效地介導(dǎo)外源基因表達(dá)。結(jié)果結(jié)果顯示分化成熟的PAEC模型為多層上皮結(jié)構(gòu),其頂端表面含有纖毛細(xì)胞、黏液分泌細(xì)胞和基底層細(xì)胞。PAEC模型的電生理學(xué)特性-上皮細(xì)胞跨膜電阻在一定時(shí)期內(nèi)保持穩(wěn)定,表明PAEC細(xì)胞間連接的形成和跨細(xì)胞間離子運(yùn)輸?shù)钠胶�。本研究通過(guò)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法成功制備了重組腺相關(guān)病毒rAAV6-GFP,其能夠通過(guò)頂端表面感染PAEC,有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞。結(jié)論本文構(gòu)建的豬呼吸道上皮細(xì)胞體外分化模型能夠模擬人呼吸道的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征,為呼吸道病原體感染機(jī)制、呼吸系統(tǒng)疾病藥物篩選和基因療法等研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬呼吸道上皮細(xì)胞 氣液界面培養(yǎng) 腺相關(guān)病毒
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R56;R-332
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-7
• 縮略詞表(ABBREVIATION INDEX)7-8
• 前言8-12
• 1 人呼吸道上皮細(xì)胞8
• 2 呼吸道模型的研究進(jìn)展8-11
• 3 豬呼吸道模型11
• 4 研究目的與意義11-12
• 材料與方法12-34
• 1 實(shí)驗(yàn)材料12-17
• 2 實(shí)驗(yàn)方法17-34
• 結(jié)果34-40
• 1 豬呼吸道上皮細(xì)胞體外分化模型的建立34-35
• 2 豬呼吸道上皮細(xì)胞體外分化模型的鑒定35-37
• 3 重組腺相關(guān)病毒rAAV6-GFP的制備及定量37-39
• 4 AAV6可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)豬呼吸道上皮細(xì)胞39-40
• 討論40-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-49
• 綜述49-61
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷61-62
• 碩士階段論文發(fā)表情況62-63
• 致謝63-64

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 張少丹;李武平;;呼吸道上皮細(xì)胞模型的研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2015年03期

2 張少丹;劉紅梅;劉忠;李武平;;豬呼吸道上皮細(xì)胞體外分化模型的建立及其應(yīng)用研究[J];病毒學(xué)報(bào);2015年04期

3 田亮;穆秦;岳登;付塞琴;;豬流感病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)的研究進(jìn)展[J];中國(guó)豬業(yè);2015年01期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 溫世勇;17-β雌二醇調(diào)控綿羊輸卵管上皮細(xì)胞β-防御素1基因表達(dá)過(guò)程中NF-κB信號(hào)通路的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 紀(jì)笑英;Th2/Th17偏轉(zhuǎn)微環(huán)境對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞重塑的作用及其機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 劉大鵬;鈣激活氯離子通道對(duì)哮喘氣道杯狀細(xì)胞凋亡與黏液高分泌的影響[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

2 陳葉雨;魚(yú)類(lèi)β-防御素的生物學(xué)活性研究及其互作蛋白的篩選[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

3 李妍妍;四個(gè)新的鴿β-防御素抗新城疫病毒作用機(jī)制的初步研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：豬呼吸道上皮細(xì)胞體外分化模型的建立及其應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：333567