目的:篩選核受體家族中對乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）增強子或核心啟動子轉錄活性有影響的基因,初步研究生殖細胞核因子（germ cell nuclear factor,NR6A1）對HBV轉錄與復制的調控作用。方法:克隆帶有核受體家族基因的表達質粒,與海腎熒光素酶報告質粒pcore-Rluc共轉染,轉染后檢測熒光素酶活性,篩選對增強子或核心啟動子轉錄活性有影響的核受體基因。然后在Hep G2細胞中共轉染HBV1.3倍體質粒與NR6A1表達質粒;通過Southern blot檢測細胞內復制的HBV DNA;Northern blot檢測HBV RNA的轉錄情況。結果:篩選出對HBV增強子/核心啟動子有明顯影響的基因NR6A1,其作用與對照組（空載和pcore-Rluc共轉染）相比,Rluc活性下降約80%,對照組為1.000±0.319,NR6A1組為0.198±0.009（P=0.000）。NR6A1過表達時,BCP（核心啟動子,PCH9-1744-Rluc）實驗組熒光素酶活性相對值（0.504±0.023）較對照組（空載和PCH9-1744-Rluc共轉染,1... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學學報. 2019,44(03)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

HepG2細胞中不同核受體基因過表達對熒光素酶活性的影響

=0.000），說明在HepG2細胞中過表達NR6A1可以明顯抑制HBVDNA的復制水平。2.5NR6A1在HepG2細胞中過表達抑制HBVRNA轉錄上述結果證明NR6A1能夠抑制HBVDNA復制。為了進一步研究抑制作用是否是通過抑制HBVRNA轉錄水平所引起的，分別將NR6A1表達質粒與HBV1.3（實驗組）或者空載體與HBV1.3（對照組）共轉染HepG2細胞，Northernblot檢測細胞總RNA。Northernblot結果提示實驗組RNA表達量相對于對照組明顯下降（圖4），RNA表達灰度值相對定量a：與對照組比較，P＜0.05圖1HepG2細胞中不同核受體基因過表達對熒光素酶活性的影響圖2Westernblot檢測NR6A1過表達a：與對照組比較，P＜0.05圖3NR6A1過表達在HepG2細胞中可抑制HBVDNA復制相對熒光素酶活性1.51.00.50.0ControlNR1D2NR1I3NR6A1THRBRARGNR3C2NR1H2RORAaaaaaaaaNR6A1-3Flagβ-actin56kD43kDVector+HBV1.3NR6A1+HBV1.3NR6A1+HBV1.3Vector+HBV1.3Vector+HBV1.3NR6A1+HBV1.3rcDNAssDNAcoreDNA12孔板6孔板1.51.00.50.0HBVDNA灰度值相比aVector+HBV1.3NR6A1+HBV1.3—292—

A的復制水平。2.5NR6A1在HepG2細胞中過表達抑制HBVRNA轉錄上述結果證明NR6A1能夠抑制HBVDNA復制。為了進一步研究抑制作用是否是通過抑制HBVRNA轉錄水平所引起的，分別將NR6A1表達質粒與HBV1.3（實驗組）或者空載體與HBV1.3（對照組）共轉染HepG2細胞，Northernblot檢測細胞總RNA。Northernblot結果提示實驗組RNA表達量相對于對照組明顯下降（圖4），RNA表達灰度值相對定量a：與對照組比較，P＜0.05圖1HepG2細胞中不同核受體基因過表達對熒光素酶活性的影響圖2Westernblot檢測NR6A1過表達a：與對照組比較，P＜0.05圖3NR6A1過表達在HepG2細胞中可抑制HBVDNA復制相對熒光素酶活性1.51.00.50.0ControlNR1D2NR1I3NR6A1THRBRARGNR3C2NR1H2RORAaaaaaaaaNR6A1-3Flagβ-actin56kD43kDVector+HBV1.3NR6A1+HBV1.3NR6A1+HBV1.3Vector+HBV1.3Vector+HBV1.3NR6A1+HBV1.3rcDNAssDNAcoreDNA12孔板6孔板1.51.00.50.0HBVDNA灰度值相比aVector+HBV1.3NR6A1+HBV1.3—292—


本文編號：3331366