本文關(guān)鍵詞：傷寒沙門菌sufC基因及t4606基因的生物學(xué)功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:課題組前期研究發(fā)現(xiàn)傷寒沙門菌suf C及t4606基因的表達受兩個重要的調(diào)節(jié)因子Rpo E和Rpo S的雙重調(diào)控,推測其可能在傷寒沙門菌致病過程中發(fā)揮重要作用。suf C在其他腸道致病菌中對鐵離子的轉(zhuǎn)運至關(guān)重要,參與細菌對抗宿主細胞的氧化應(yīng)激;傷寒沙門菌t4606基因編碼一未知功能的蛋白質(zhì),對其基因序列分析發(fā)現(xiàn)具有Patatin-like phospholipase的功能基序,本研究旨在對suf C基因及t4606基因在傷寒沙門菌中的功能進行鑒定,揭示兩者在傷寒沙門菌致病過程中的作用。方法:一、傷寒沙門菌suf C功能研究(1)suf C基因缺陷變異株的制備:用特異性引物擴增帶有suf C基因上下游同源臂的卡那霉素抗性基因片段,將其電轉(zhuǎn)至含p KD46的傷寒沙門菌野生株,利用λ-Red系統(tǒng)制備suf C的基因缺陷株。(2)suf C基因缺陷回補株的制備:構(gòu)建重組質(zhì)粒p ACYC184-suf C,將其及p ACYC184空質(zhì)粒導(dǎo)入suf C基因缺陷株,制備suf C基因的缺陷回補株及空質(zhì)�；匮a對照株。(3)生長曲線的測定:分別測定S.Typhi野生株、suf C基因缺陷株、suf C基因缺陷回補株和空質(zhì)�；匮a對照株在正常條件、高滲應(yīng)激、酸和氧應(yīng)激條件下的生長曲線,比較各菌株的生長差異。(4)suf C基因缺陷株的上皮細胞侵襲實驗:將傷寒沙門菌野生株、suf C基因缺陷變異株及其回補株和空質(zhì)�；匮a對照株培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600 0.4),分別感染He La細胞(MOI均為10),分析各菌株對上皮細胞侵襲力的差異。(5)suf C基因缺陷株在巨噬細胞內(nèi)的生存實驗:將傷寒沙門菌野生株、suf C基因缺陷變異株及其回補株和空質(zhì)�；匮a對照株培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600 0.4),分別感染THP-1巨噬細胞(MOI均為10),比較各菌株在巨噬細胞內(nèi)的生存能力差異,同時在細菌感染巨噬細胞的不同時間點測定上清液中巨噬細胞相關(guān)細胞因子的表達水平。二、傷寒沙門菌t4606基因功能研究(1)t4606基因缺陷變異株的制備:構(gòu)建t4606基因缺損型同源核苷酸片段,采用自殺質(zhì)粒p GMB151介導(dǎo)的同源重組方法制備傷寒沙門菌t4606缺陷變異株。(2)t4606基因缺陷回補株的制備:構(gòu)建重組質(zhì)粒p BAD-t4606,將其及空質(zhì)粒p BAD分別導(dǎo)入t4606基因缺陷變異株,制備suf C基因缺陷回補株和空質(zhì)粒回補對照株。(3)生長曲線測定:測定S.Typhi野生株、t4606基因缺陷株、t4606基因缺陷回補株、空質(zhì)�；匮a對照株在普通條件、高滲應(yīng)激、酸應(yīng)激和氧應(yīng)激條件下的生長曲線,比較各菌株的生長差異。(4)t4606基因缺陷株的上皮細胞侵襲實驗,方法同上述傷寒沙門菌t4606基因缺陷株的上皮細胞侵襲實驗。(5)t4606基因缺陷株在巨噬細胞內(nèi)生存實驗,方法同上述傷寒沙門菌t4606基因缺陷株的胞內(nèi)生存實驗。結(jié)果:(1)經(jīng)PCR及序列分析驗證,成功制備了傷寒沙門菌suf C、t4606基因缺陷株及其回補株和空質(zhì)�；匮a對照株。(2)生長曲線表明,suf C缺陷株在普通條件和高滲應(yīng)激條件下與野生株的生存能力無明顯差異,而在氧應(yīng)激條件下,suf C缺陷株的生長明顯遲緩于野生株,回補suf C基因至suf C缺陷株后,回補株的生長恢復(fù)至野生株水平。(3)與野生株相比,suf C缺陷株對上皮細胞的侵襲力明顯減弱。(4)與野生株相比,suf C缺陷株在巨噬細胞內(nèi)的生存能力明顯減弱;野生株與suf C缺陷株感染巨噬細胞后,細胞培養(yǎng)上清中均有細胞因子TNF和IL-6的表達,但在suf C缺陷株中TNF和IL-6的表達水平均明顯低于野生株。(5)在普通生長條件和氧應(yīng)激條件下,t4606的缺失對傷寒沙門菌的生長無影響,但在高滲應(yīng)激條件下,t4606缺陷株的生長明顯遲緩于野生株,回補t4606基因至t4606缺陷株后,回補株的生長恢復(fù)至野生株水平。(6)與野生株相比,t4606缺陷株在巨噬細胞內(nèi)的生存能力及其對hela細胞的侵襲力無明顯差異。結(jié)論:通過兩種細菌基因缺失制備系統(tǒng),我們成功制備了傷寒沙門菌suf C和t4606基因缺陷株及其回補株和空質(zhì)�；匮a對照株。本研究表明,suf C基因有助于傷寒沙門菌在氧應(yīng)激環(huán)境下的生長,促進傷寒沙門菌在巨噬細胞內(nèi)的存活,且明顯增強傷寒沙門菌對上皮細胞的侵襲力,提示suf C基因?qū)τ趥抽T菌在致病過程中的侵襲和胞內(nèi)生存兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有重要的促進作用。同時,t4606基因促進傷寒沙門菌在高滲應(yīng)激環(huán)境下的生長,而對傷寒沙門菌的侵襲力及在巨噬細胞內(nèi)的存活能力無明顯影響,說明t4606基因可能在傷寒沙門菌感染過程中主要發(fā)揮抵抗腸道高滲環(huán)境的作用。
【關(guān)鍵詞】：傷寒沙門菌 sufC t4606 功能 侵襲 胞內(nèi)生存
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 緒論11-15
• 第一章 傷寒沙門菌sufC基因功能研究15-38
• 1.1 材料15-17
• 1.2 方法17-26
• 1.3 結(jié)果26-37
• 1.4 討論37-38
• 第二章 傷寒沙門菌t4606 基因功能研究38-56
• 2.1 材料38
• 2.2 實驗方法38-45
• 2.3 結(jié)果45-54
• 2.4 討論54-56
• 結(jié)論與展望56-57
• 參考文獻57-60
• 綜述：沙門菌毒力基因的研究進展60-70
• 參考文獻65-70
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文70-71
• 中英文對照縮略詞表71-72
• 致謝72-73

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