目的:原核表達柯薩奇病毒B組5型的VP1蛋白,并制備其多克隆抗體及檢測。方法:提取在Vero細胞中柯薩奇病毒B組5型的RNA,通過逆轉錄PCR（RT-PCR）擴增獲取VP1基因序列,構建原核表達載體,大量誘導表達重組VP1蛋白。用His Trap HP親和層析柱純化重組蛋白,以純化的目的蛋白為抗原,免疫雄性SD大鼠獲得VP1蛋白多克隆抗體血清,ELISA測定該抗體的效價,微量中和實驗測定抗體的中和活性,Western blot檢測抗體的特異性,免疫組化檢測抗體對組織中抗原的識別。結果:成功構建了VP1-pET-28a重組載體,并且在BL21細胞中成功誘導表達,親和層析柱純化后蛋白純度大于90%。ELISA測得抗體的效價為1∶128 000,微量中和實驗顯示抗體沒有中和活性,Western blot分析顯示抗體能與CVA16和EV71交叉反應,免疫組化實驗表明抗體能夠識別組織中的CVB5抗原。結論:本研究成功制備了CVB5 VP1蛋白的高效價的多克隆抗體,為CVB5病毒疫苗和病毒診斷的研發(fā)提供了有效的工具。 

【文章來源】：中國免疫學雜志. 2019,35(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

VP1片段擴增及重組載體的驗證Fig．1AmplificationofVP1fragmentandverificationof

圖4抗體對CVA16和EV71的交叉識別能力Fig．4CrossrecognitionabilityofantibodytoCVA16andEV71圖5抗體識別腦組織CVB5抗原的免疫組化染色結果(×200)Fig．5ImmunohistochemicalstainingresultsofCVB5an-tigenidentifiedbyantibodyinbraintissue(×200)陰性血清做對照。圖5A為對照組片子，其中沒有棕色顆粒物，而實驗組中則有明顯的棕色顆粒，即圖5B中箭頭所指示，表明制得的抗體可用于免疫組化實驗。3討論近年來CVB5在世界范圍內開始流行，如2006年在法國有23%的腦膜炎患者確定為CVB5感染［7］;在2003年至2004年，希臘也報道了CVB5引起的無菌性腦膜炎的流行［8］;在2005年和2009年，我國山東和河南也爆發(fā)了CVB5感染引發(fā)的無菌性腦膜炎［9］。雖然CVB5感染引起的疾病多是自限性的，但腦膜炎的疾病是有后遺癥的。因此，CVB5的抗病毒藥物及疫苗的研究和快速的臨床診斷是非常迫切的。疫苗研究及臨床診斷都需要用特異性抗體來檢測病毒抗原。Opanda等［10］的研究表明，CVB5病毒顆粒的主要中和抗原表位位于VP1區(qū)。綜上，本研究將目標瞄向了CVB5衣殼亞單位VP1蛋白多克隆抗體的制備。本實驗成功構建了CVB5VP1基因的原核表達載體VP1-pET-28a，并將其在BL21細胞中大量誘導表達。重組VP1蛋白C、N兩端都有His標簽，因此我們利用HisTrapHP親和層析柱對重組蛋白進行純化。純化后的目的蛋白純度大于90%，符合多克隆抗體制備的要求。純化后的目的蛋白與弗氏佐劑混合后，分多次、多位點皮下注射免疫SD大鼠，獲得了VP1

圖4抗體對CVA16和EV71的交叉識別能力Fig．4CrossrecognitionabilityofantibodytoCVA16andEV71圖5抗體識別腦組織CVB5抗原的免疫組化染色結果(×200)Fig．5ImmunohistochemicalstainingresultsofCVB5an-tigenidentifiedbyantibodyinbraintissue(×200)陰性血清做對照。圖5A為對照組片子，其中沒有棕色顆粒物，而實驗組中則有明顯的棕色顆粒，即圖5B中箭頭所指示，表明制得的抗體可用于免疫組化實驗。3討論近年來CVB5在世界范圍內開始流行，如2006年在法國有23%的腦膜炎患者確定為CVB5感染［7］;在2003年至2004年，希臘也報道了CVB5引起的無菌性腦膜炎的流行［8］;在2005年和2009年，我國山東和河南也爆發(fā)了CVB5感染引發(fā)的無菌性腦膜炎［9］。雖然CVB5感染引起的疾病多是自限性的，但腦膜炎的疾病是有后遺癥的。因此，CVB5的抗病毒藥物及疫苗的研究和快速的臨床診斷是非常迫切的。疫苗研究及臨床診斷都需要用特異性抗體來檢測病毒抗原。Opanda等［10］的研究表明，CVB5病毒顆粒的主要中和抗原表位位于VP1區(qū)。綜上，本研究將目標瞄向了CVB5衣殼亞單位VP1蛋白多克隆抗體的制備。本實驗成功構建了CVB5VP1基因的原核表達載體VP1-pET-28a，并將其在BL21細胞中大量誘導表達。重組VP1蛋白C、N兩端都有His標簽，因此我們利用HisTrapHP親和層析柱對重組蛋白進行純化。純化后的目的蛋白純度大于90%，符合多克隆抗體制備的要求。純化后的目的蛋白與弗氏佐劑混合后，分多次、多位點皮下注射免疫SD大鼠，獲得了VP1

【參考文獻】：
期刊論文
[1]諾如病毒NV衣殼蛋白VP1表達純化及多克隆抗體的制備[J]. 仉秋實,苑榮亮,井申榮.  中國微生態(tài)學雜志. 2017(08)
[2]Etiology, pathogenesis, antivirals and vaccines of hand,foot, and mouth disease[J]. Xiaobo Lei,Sheng Cui,Zhendong Zhao,Jianwei Wang.  National Science Review. 2015(03)



本文編號：3304173