目的研制剛地弓形蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）兔多克隆抗體（多抗）并分析其診斷價值。方法在大腸埃希菌BL21重組表達菌表達TPI,鎳柱親和層析法純化后與弗氏佐劑等體積混合,頸背部多點注射免疫新西蘭大白兔（TPI 200μg/次,共3次）。末次免疫后2周收集兔血清, Protein A親和層析純化多抗。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析多抗純度, ELISA分析多抗效價,蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）及ELISA分析多抗識別弓形蟲排泄分泌抗原及純化TPI的效果。利用多抗偶聯(lián)磁珠,富集11份弓形蟲感染小鼠和11份健康小鼠血清后, Dot-blot分析多抗的診斷價值,并與弓形蟲循環(huán)抗原ELISA試劑盒的檢測結(jié)果作比較。結(jié)果表達并純化獲得條帶單一的TPI蛋白。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,免疫兔血清經(jīng)Protein A親和純化后獲得的多抗,重鏈與輕鏈清晰可見。第3次免疫后兔血清抗體效價可達1∶280 000以上;純化后的多抗純度高,效價可達1∶100 000以上; Western blotting分析結(jié)果顯示,純化的多抗能識別弓形蟲排泄分泌抗原中的TPI及純... 

【文章來源】：中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志. 2019,37(03)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

SDS-PAGE分析純化TPI多抗250001800014000M：蛋白質(zhì)標(biāo)志物；1：純化后多抗M:Proteinmarker

中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志2019年6月第37卷第3期ChinJParasitolParasitDisJune2019，Vol.37，No.3化過程中丟失了參與三羧酸循環(huán)和β-氧化代謝途徑所需酶的基因。糖酵解是生物獲取能量最原始的一種方式，其產(chǎn)生的ATP是頂復(fù)門原蟲能量的惟一來源［14-18］。TPI在糖酵解過程中具有催化磷酸二羥基丙酮轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛的作用，對于弓形蟲合成脂肪酸具有關(guān)鍵作用［19］。感染宿主后，弓形蟲可分泌TPI至宿主體內(nèi)，故在宿主體內(nèi)TPI豐度較高［12］，具有較強的免疫原性［13］，容易制備高敏感性的多抗或單抗。弓形蟲的檢測方法包括檢測弓形蟲特異性抗原及抗體。檢測弓形蟲特異性抗體不能區(qū)分患者是新近感染還是過往感染，是活動性感染還是隱性感染。檢測IgM和IgG的親和力變化可用于活動性感染的診斷［20］，但由于IgM可長期存在于患者體內(nèi)，而親和力改變的判斷閾值通常難以確定，因此具有局限性［21］。檢測弓形蟲循環(huán)抗原是弓形蟲病診斷的理想手段，但目前尚無理想的檢測靶標(biāo)。本研究利用TPI重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多抗，該多抗可識別弓形蟲排泄分泌抗原中的TPI，也可富集弓形蟲感染小鼠血清中的TPI。弓形蟲活動性感染者少，血清較難收集，因此本研究僅用弓形蟲感染小鼠血清評價該多抗的診斷價值，該多抗在臨床診斷中的作用還需進一步驗證。該多抗可為構(gòu)建高敏感性、高特異性的弓形蟲活動性感染檢測方法奠定基礎(chǔ)，可作為現(xiàn)有弓形蟲循環(huán)抗原檢測試劑盒檢測方法的有效補充，對促進弓形蟲病的防治、優(yōu)生優(yōu)育及人民健康水平的提高，具有積極的作

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Ⅰ型干擾素在原蟲感染中的作用[J]. 馬遠林,呂芳麗.  中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志. 2018(04)
[2]弓形蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶原核表達及免疫保護的初步研究[J]. 沈雙,殷旭仁,宋麗君,王玠,柯雪丹,周偉,余傳信.  中國血吸蟲病防治雜志. 2017(06)
[3]應(yīng)用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定弓形蟲病診斷抗原分子的研究[J]. 沈雙,肖迪,宋麗君,余傳信,張建中,殷旭仁,高玒,王玠,柯雪丹,許永良,楊靜,唐鳳,仝德勝.  中國病原生物學(xué)雜志. 2015(02)
[4]頂復(fù)門原蟲糖酵解代謝及其關(guān)鍵酶:己糖激酶的研究進展[J]. 孫銘飛,吳彩艷,戚南山,廖申權(quán),呂敏娜,蔡建平.  畜牧與獸醫(yī). 2011(11)



本文編號：3303200