本文關(guān)鍵詞：腸道病毒71型不同毒力表型株復(fù)制差異研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腸道病毒71型(entero virus 71, EV71)是繼脊髓灰質(zhì)炎病毒后出現(xiàn)的又一具有神經(jīng)嗜性的腸道病毒。EV71感染后臨床癥狀表現(xiàn)多樣,一般只引起典型的手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFMD),嚴重者可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,甚至死亡。EV71的基因組包括一個開放閱讀框(open reading frame, ORF)及兩邊的5'非編碼區(qū)(5'untranslated region,5'UT R)和3'非編碼區(qū)(3'untranslated region,3'UTR)。目前,對于EV71的致病機制,特別是導(dǎo)致嚴重中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)感染的機制尚未取得突破性進展。不同的EV71毒株引起不同的臨床癥狀,除了個體易感因素外,病毒本身的復(fù)制能力在EV71的致病中發(fā)揮著重要作用。據(jù)此,本論文首先研究了分離自不同臨床表現(xiàn)患兒中的EV71不同毒力表型株的復(fù)制情況,并進一步通過微復(fù)制子和反向遺傳技術(shù)研究5'UTR區(qū)在病毒復(fù)制中的作用。目的：1.本研究首先對EV71不同毒力表型株做復(fù)制差異分析,以期發(fā)現(xiàn)EV71不同毒力表型株在RD細胞中的復(fù)制差異,并明確復(fù)制能力與EV71致病機制之間的關(guān)系。2.構(gòu)建EV71的微復(fù)制子體系,研究EV71非編碼區(qū)對病毒表達和復(fù)制的影響機制。3.構(gòu)建EV71全長感染性克隆cDNA以及5'UTR置換的重組病毒,研究5'UTR區(qū)在病毒復(fù)制中的作用。方法：1.將EV71高毒力表型株(SDLY107和SDLY52)和低毒力表型株(SDLY11和SDLY1)感染RD細胞后,在不同的溫度下(37℃ VS 39.5℃)進行培養(yǎng),每12h取一次上清樣。連續(xù)取4天。樣本放于-80℃保存,樣本取完后進行樣本病毒RNA的提取,并進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。對逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進行實時熒光定量PCR檢測(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)。每12h作為一個病毒生長檢測點檢測病毒的復(fù)制曲線以期發(fā)現(xiàn)EV71不同毒力表型株在RD細胞中的復(fù)制差異。2.以SDLY107的基因組為模板,PCR擴增EV71的5'UTR與3'UTR,以EGFP基因替換EV71的ORF區(qū),構(gòu)建EV71的微復(fù)制子體系pMD-19T-5'UTR-EGFP-3'UTR。研究EV71非編碼區(qū)對病毒表達和復(fù)制的影響機制。3.采用分段擴增的方法擴增SDLY107毒株的基因組,采用酶切連接的方法構(gòu)建EV71的全長感染性克隆pCDNA3.1(+)-SDLY107.將pCDNA3.1(+)-SDLY107質(zhì)粒線性化,并以其為模板進行體外轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染RD細胞并培養(yǎng)。細胞病變(cytopathic effect, CPE)產(chǎn)生后收獲病毒并接種新的RD細胞,反復(fù)盲傳直至CPE穩(wěn)定后收獲病毒即拯救病毒。4.以EV71低毒力表型株SDLY1的5'UTR置換EV71高毒力表型株SDLY107的5'UTR,構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-SDLY107-1。將拯救的野生型SDLY107和重組病毒SDLY107-1以不同感染劑量感染RD細胞,并在不同的溫度下培養(yǎng),以qRT-PCR檢測病毒的復(fù)制曲線。結(jié)果：1.EV71高毒力表型株(SDLY107和SDLY52)和低毒力表型株(SDLY11和SDLY1)的生長曲線顯示,在高溫(39.5℃)下,高毒力表型株的復(fù)制能力顯著高于低毒力表型株。而培養(yǎng)溫度為37℃時,高毒力表型株和低毒力表型株的復(fù)制能力沒有顯著差異。此外,在高溫下進行培養(yǎng)時,高毒力表型株和低毒力表型株的復(fù)制均受到抑制。說明EV71高毒力表型株是溫度耐受型毒株,而EV71低毒力表型株是溫度敏感性毒株。2.EV71的微復(fù)制子體系顯示,在轉(zhuǎn)染5'UTR-EGFP-3'UTR RNA的RD細胞中能觀察到熒光,而轉(zhuǎn)染EV71 UTR區(qū)缺失的EGFP RNA時并無熒光蛋白的表達,說明UTR區(qū)是EV71蛋白表達的調(diào)控區(qū)。然而,EV71的微復(fù)制子體系在RD細胞中沒有出現(xiàn)RNA復(fù)制現(xiàn)象,說明只含有EV71的UTR區(qū)并不能獨立完成RNA的復(fù)制,此外還需要ORF區(qū)中某些關(guān)鍵元件的參與。3.細胞培養(yǎng)和復(fù)制曲線檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)EV71拯救病毒的致細胞病變和生長特性與野生型EV71基本一致。證實EV71拯救技術(shù)成功。4.在高溫(39.5℃)培養(yǎng)條件下,我們發(fā)現(xiàn)對EV71的5'UTR進行交換后(高毒力表型株的5'UTR被低毒力表型株置換),EV71的復(fù)制能力明顯受到影響,即置換低毒力表型株的5'UTR后,EV71高毒力表型株的復(fù)制能力下降。而在常規(guī)溫度(37℃)下,重組病毒和母本病毒的復(fù)制能力沒有顯著區(qū)別,說明5'UTR與EV71不同毒力表型株復(fù)制差異有關(guān),并且5'UTR區(qū)存在溫度敏感位點。結(jié)論：1.EV71不同臨床表型分離株在高溫下復(fù)制能力不同,這可能是EV71不同毒力表型導(dǎo)致不同臨床癥狀的致病機制之一。2.5'UTR替換之后,EV71強毒力表型株在高溫下的復(fù)制能力明顯減弱,說明5'UTR是EV71致病機制中重要的毒力決定位點區(qū)。
【關(guān)鍵詞】：EV71 5'UTR 復(fù)制 毒力位點
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R373.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 符號說明12-13
• 前言13-21
• 一、腸道病毒71型13-15
• 二、EV71的毒力位點研究15-17
• 三、EV71的致病機制研究17-21
• 材料與方法21-41
• 一、材料21-26
• 二、方法26-41
• 結(jié)果41-56
• 一、EV71不同毒力表型株在RD細胞中的復(fù)制曲線41-44
• 二、EV71微復(fù)制子體系的鑒定、表達和復(fù)制44-48
• 三、SDLY107株全長感染性克隆構(gòu)建、拯救以及生長曲線分析48-52
• 四、重組病毒構(gòu)建、拯救以及5'UTR對EV71復(fù)制的作用分析52-56
• 討論56-61
• 結(jié)論61-62
• 創(chuàng)新之處62-63
• 附錄、附圖63-66
• 參考文獻66-75
• 致謝75-76
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文76-77
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表77

  本文關(guān)鍵詞：腸道病毒71型不同毒力表型株復(fù)制差異研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：326522