本文關鍵詞：IL-35修飾的間充質干細胞免疫調節(jié)性能初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本實驗通過分離大鼠間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs),使用攜帶IL-35基因片段的表達載體轉染MSCs細胞,在體外建立MSCs與DC、T細胞共培養(yǎng)體系,探討修飾后的MSCs的免疫調節(jié)作用。方法:(1)無菌條件下分離Sprague-Dawley(SD)大鼠股骨和脛骨,使用全骨髓貼壁法培養(yǎng)MSCs,胰酶消化傳代培養(yǎng)。待培養(yǎng)至第3代時進行流式檢測,鑒定分離的MSCs體外分化的潛能。(2)使用LPS處理3天的人外周血單核細胞c DNA為模板,擴增獲得EBi3和p35基因片段,再通過重疊PCR方法,人工合成了IL-35片段,將其克隆進真核表達載體p MSCV-IRES-GFP中,提取質粒后瞬時轉染MSCs,Real-time PCR檢測修飾后的MSCs基因表達情況,ELISA檢測細胞上清中IL-10、TGF-β1、IL-12的分泌情況。(3)密度梯度離心法分離培養(yǎng)Wistar大鼠骨髓未成熟DC細胞,建立修飾后的MSCs與DC細胞的體外共培養(yǎng)體系,分為直接接觸組和間接接觸組,流式檢測共培養(yǎng)48小時后DC表型的變化,ELISA檢測DC細胞分泌IL-12的變化情況。(4)建立修飾后的MSCs與脾臟T細胞的體外共培養(yǎng)體系,分為直接接觸組和間接接觸組,流式檢測CD8+T細胞和CD4+CD25+調節(jié)T細胞(Tregs)水平,MTS檢測T細胞增殖,Real-time PCR檢測與T細胞共培養(yǎng)后MSCs的IL-10和TGF-β基因表達情況。結果:(1)使用全骨髓貼壁法培養(yǎng)的MSCs成細長梭形狀,形似成纖維細胞,排列均勻,成漩渦狀生長,流式檢測其高表達CD29、CD44和CD90分子,分別為84.12%、90.77%、97.27%,而幾乎不表達造血系的CD34和CD45分子,分別為1.87%、1.06%。證實所獲得的MSCs為典型的間充質干細胞,第三代MSCs在體外經(jīng)誘導后可向脂肪細胞和軟骨細胞分化,證實其具有良好的分化潛能。(2)PCR擴增獲得630bp的EBi3片段和590bp的p35成熟片段,通過重疊PCR的方法,人工合成了IL-35基因片段(1.3kb),并成功將其克隆進真核表達載體p MSCV-IRES-GFP中,雙酶切鑒定顯示連接成功。提取質粒后瞬時轉染MSCs,檢測到修飾后MSCs表達IL-35顯著增強,同時與IL-35相關的免疫因子IL-10和TGF-β1的表達也明顯升高。ELISA檢測細胞上清顯示轉染修飾的MSCs分泌IL-10和TGF-β1水平明顯增高,而IL-12的分泌水平明顯下降。(3)通過密度梯度離心法獲得大鼠DC,流式檢測其表面成熟分子標志物CD86、CD11b/c、MHC-Ⅱ處于較低水平,分別為45.11%、70.15%、82.56%。使用LPS誘導后,CD86、CD11b/c、MHC-Ⅱ水平明顯升高,分別為78.2%、97.1%、99.47%。在MSCs與DC共培養(yǎng)體系中加入LPS誘導DC成熟,DC的最主要成熟標志CD86仍處于較低水平,MSC-IL35組和直接接觸組中顯示出更強勁抑制效力。共培養(yǎng)后細胞上清ELISA顯示DC分泌的IL-12水平明顯下降,且在MSC-IL35組下降更為明顯。(4)通過紅細胞裂解法獲得大鼠脾臟T細胞,MSCs與T細胞共培養(yǎng)后降低了CD8+T水平,增加了CD4+CD25+Tregs水平,MSC-IL-35的作用更為明顯,MTS檢測顯示在共培養(yǎng)后24小時和48小時,MSCs明顯抑制了T細胞的增殖,而MSC-IL-35的抑制作用更加明顯。Real-time PCR檢測結果顯示與T細胞共培養(yǎng)后MSCs的IL-10和TGF-β1基因表達顯著增強,其中與T細胞直接接觸組效果更為明顯。結論:轉染修飾后的MSCs能通過直接接觸和分泌細胞因子來抑制LPS所誘導的DC細胞的成熟,降低T細胞亞群CD8+T細胞的比例,增加CD4+CD25+Tregs水平,且比普通MSCs效果更為明顯,IL-35修飾后的MSCs具有更為強大的免疫調節(jié)效力,在器官移植耐受領域有更大的應用前景。
【關鍵詞】：間充質干細胞 白介素35 大鼠 免疫調節(jié) 轉染 CD4+CD25+調節(jié)性T細胞
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392.12
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語10-12
• 前言12-14
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-14
• 一、間充質干細胞的分離與培養(yǎng)14-22
• 1.1 對象和方法14-17
• 1.1.1 研究對象14
• 1.1.2 實驗材料14-16
• 1.1.3 實驗方法16-17
• 1.2 結果17-19
• 1.2.1 MSCs的形態(tài)特征17-18
• 1.2.2 MSCs的凍存與復蘇18
• 1.2.3 流式細胞儀檢測MSCs表面標志物18-19
• 1.2.4 MSCs體外誘導鑒定19
• 1.3 討論19-21
• 1.4 小結21-22
• 二、IL-35基因修飾大鼠MSCs22-35
• 2.1 對象和方法22-29
• 2.1.1 研究對象22
• 2.1.2 實驗材料22-24
• 2.1.3 實驗方法24-29
• 2.2 結果29-32
• 2.2.1 重疊PCR獲得EBi3-p35片段29-30
• 2.2.2 重組質粒pMSCV-IL35GFP的鑒定30-31
• 2.2.3 MSCs修飾后的鑒定31-32
• 2.2.4 經(jīng)IL-35修飾的MSCs相關細胞因子分泌量變化32
• 2.3 討論32-34
• 2.4 小結34-35
• 三、IL-35基因修飾MSCs對DC的影響35-43
• 3.1 研究對象和方法35-38
• 3.1.1 研究對象35
• 3.1.2 實驗材料35-36
• 3.1.3 實驗方法36-38
• 3.2 結果38-41
• 3.2.1 DC細胞的形態(tài)特征38-39
• 3.2.2 DC細胞表面表型39-40
• 3.2.3 MSC及MSC-IL35抑制LPS所誘導的DC成熟40
• 3.2.4 共培養(yǎng)后DC上清中IL-12含量檢測40-41
• 3.3 討論41-42
• 3.4 小結42-43
• 四、IL-35基因修飾MSCs對T細胞的影響43-51
• 4.1 研究對象和方法43-47
• 4.1.1 研究對象43
• 4.1.2 實驗材料43-44
• 4.1.3 實驗方法44-47
• 4.2 結果47-49
• 4.2.1 MSCs對脾臟T細胞分型的影響47-48
• 4.2.2 MTS檢測結果48-49
• 4.2.3 Real-time PCR檢測結果49
• 4.3 討論49-50
• 4.4 小結50-51
• 結論51-52
• 參考文獻52-57
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明57-58
• 綜述 MSCs的生物學特性及其在器官移植領域的應用前景58-70
• 綜述參考文獻65-70
• 致謝70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Sait Murat Do?an;Sel?uk K?l?n?;Eyüp Kebap??;Cem Tu?men;Mustafa ?lmez;Cezmi Karaca;Alp Gürkan;Ma?allah Baran;Yusuf Kurtulmu?;;Mesenchymal stem cell therapy in patients with small bowel transplantation:Single center experience[J];World Journal of Gastroenterology;2014年25期

  本文關鍵詞：IL-35修飾的間充質干細胞免疫調節(jié)性能初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：325276