自從發(fā)現(xiàn)雙鏈21堿基小干擾RNA可以引發(fā)特異性的基因沉寂，雙鏈RNA介導(dǎo)的RNA干擾已經(jīng)逐漸在抑制基因表達(dá)方面得到了廣泛的應(yīng)用。然而，由于目前廣泛應(yīng)用的是體外合成RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法；這個(gè)方法有合成成本高、轉(zhuǎn)染效率低、容易降解、不能持續(xù)發(fā)揮作用等缺點(diǎn)。為了解決上述問題，利用人的U6核小RNA（human small nuclear RNA U6，簡(jiǎn)稱hsnU6）基因單元的特性，構(gòu)建了一種可嵌合于U6變體基因內(nèi)部持續(xù)高效表達(dá)小干擾RNA，有效特異地抑制特定基因表達(dá)的全新載體系統(tǒng)。應(yīng)用這套系統(tǒng)，檢測(cè)了針對(duì)于綠色熒光蛋白基因和CR-1基因不同靶位點(diǎn)的小干擾RNA的作用效果。結(jié)果表明，RNA干擾作用效果與RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)使這套DNA載體介導(dǎo)的RNA干擾表達(dá)系統(tǒng)能夠在功能基因組研究方面廣泛發(fā)揮作用，并有望成為基因治療大家族中重要的一員。 細(xì)胞調(diào)控因子-1是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院王以光教授獲得專利的一個(gè)新基因，GenBank號(hào)碼為GI-21703347。與正常組織細(xì)胞相比，細(xì)胞調(diào)控因子-1在多種腫瘤細(xì)胞中富集，并且由酵母雙雜交結(jié)果得知其與p21等多種蛋白相互作用。應(yīng)用構(gòu)建的小干擾RNA... 

【文章來源】：沈陽藥科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)方法
    1 大腸桿菌質(zhì)粒DNA小量提取
    2 大腸桿菌質(zhì)粒DNA大量提取
    3 限制酶切反應(yīng)
    4 去磷酸化反應(yīng)
    5 寡核苷酸片段的磷酸化
    6 PCR反應(yīng)
    7 DNA電泳及片段回收
    8 DNA連接反應(yīng)
    9 E.coli DH-5α感受態(tài)細(xì)胞的制備
    10 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化E.coli DH-5α
    11 E.coli轉(zhuǎn)化子的快速鑒定
    12 真核細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配制
    13 RNA抽提及準(zhǔn)備
    14 RT-PCR
    15 Northrtn Blot
    16 Western Blot
    17 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞
    18 熒光顯微觀察及拍照
    19 細(xì)胞增殖速度測(cè)定
    20 測(cè)定細(xì)胞的周期變化及凋亡
    21 基因組DNA片段化的檢測(cè)
    22 真核細(xì)胞的凍存
結(jié)果與討論
    第一章 小干擾RNA體內(nèi)高效表達(dá)系統(tǒng)的建立及檢測(cè)
        一. 小干擾RNA體內(nèi)高效表達(dá)系統(tǒng)的建立
            1 hsnU6RNA基因
            2 hsnU6RNA基因的PCR克隆
            3 U6變體基因的PCR克隆
            4 系統(tǒng)的完成
        二. 所構(gòu)建的載體系統(tǒng)體外及體內(nèi)活性鑒定
            1 U6變體RNA表達(dá)的體外檢測(cè)
            2 RNA干擾的體內(nèi)活性鑒定
    第二章 RNA干擾方法學(xué)的初步探討
        一. RNA干擾靶位點(diǎn)的選擇及重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            1 RNA干擾靶位點(diǎn)的選擇
            2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        二. RNA干擾不同靶位點(diǎn)的作用效果比較
            1 針對(duì)綠色熒光蛋白基因不同靶位點(diǎn)的RNA干擾效果比較
            2 針對(duì)CR-1基因不同靶位點(diǎn)的RNA干擾效果比較
    第三章 細(xì)胞調(diào)控因子-1基因生物功能的研究
        一. 細(xì)胞調(diào)控因子-1基因(CR-1)表達(dá)的下調(diào)
            1 抑制CR-1基因的小干擾RNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            2 CR-1基因表達(dá)水平的檢測(cè)
            3 CR-1基因缺失突變株的篩選和檢測(cè)
        二. 細(xì)胞調(diào)控因子-1基因(CR-1)生物功能的研究
            1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
            2 細(xì)胞增殖速度的變化
            3 細(xì)胞周期及凋亡的變化
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
碩士研究生期間發(fā)表及準(zhǔn)備中的文章及專利



本文編號(hào)：3243175