丙型肝炎是人類(lèi)最常見(jiàn)的慢性傳染性疾病之一,丙型肝炎病毒（HCV）是丙型肝炎的致病原。目前還沒(méi)有有效地預(yù)防和根治此病的方法。HCVNS3是病毒基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白,具有多種功能。其氨基端的NS3蛋白酶（1-180aa）是有效抑制病毒復(fù)制的重要靶點(diǎn)。本研究利用蛋白重組技術(shù)和噬菌體表面展示技術(shù),設(shè)計(jì)表達(dá)和篩選具有抑制HCVNS3蛋白酶活性的抑制多肽,為特異性抗HCV的多肽藥物研究奠定基礎(chǔ)。 方法:（1） 用原核表達(dá)載體pQE-30分別構(gòu)建含有NS3蛋白酶基因的pQE/NS3和含有單鏈NS3/4A基因的pQE/NS3/4A重組質(zhì)粒;用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15,化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白并采用離子交換層析純化蛋白。（2） 用酵母轉(zhuǎn)化載體pPICZαA,構(gòu)建含有NS3蛋白酶基因克隆的pPICZaA/NS3和含有單鏈NS3/4A克隆的pPICZαA/NS3/4A重組質(zhì)粒;用重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化酵母GS115,甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并分級(jí)沉淀純化NS3蛋白酶。（3） 利用高效原核表達(dá)載體pBVIL1和基因合成的方法,構(gòu)建蛋白酶催化底物NS5A-B重組表達(dá)質(zhì)粒pBVIL1/NS5A-B,轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101,熱誘... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：116 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

seNS3/4A和NS3基因片段1SCNS3/4A2.NS3

圖.63pQE八53和pQEslcNs314A表達(dá)載體的酶切鑒l重組表達(dá)載體BamHIH/ind111酶切2NS3PeR產(chǎn)物4seNs3/4ApCR產(chǎn)物4pQE/seNs3/4ABma萬(wàn)I用nidll(圖1.3)。進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果(圖1.4)。

2345PQE加53PQEN/53/4ANS3seNS3/4A圖.63pQE八53和pQEslcNs314A表達(dá)載體的酶切鑒定l重組表達(dá)載體BamHIH/ind111酶切2NS3PeR產(chǎn)物3Marker(DLZ004seNs3/4ApCR產(chǎn)物4pQE/seNs3/4ABma萬(wàn)I用nidlll酶切相同的片段產(chǎn)生(圖1.3)。進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證實(shí)所構(gòu)建的重表達(dá)載體正確(圖1.4)。()aNS3

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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