目的:原核表達(dá)人降鈣素原（procalcitonin,PCT）重組蛋白,制備高純度的PCT單克隆抗體。方法:將構(gòu)建的PCT-pET22b表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)PCT蛋白,經(jīng)Ni-NTA親和層析法純化,用蛋白質(zhì)印跡法和膠體金法對(duì)其進(jìn)行鑒定。獲得的PCT重組蛋白采用長(zhǎng)程免疫法皮下多點(diǎn)注射Balb/c小鼠,取小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）融合,篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株并進(jìn)行亞克隆4次。將細(xì)胞株注入小鼠腹腔收集腹腔積液獲得單克隆抗體,經(jīng)辛酸硫酸銨法和Protein G親和層析法進(jìn)行純化。結(jié)果:SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在相對(duì)分子質(zhì)量約14 k Da處有一明顯條帶,與目的蛋白大小相符。蛋白質(zhì)印跡法和膠體金法證明該可溶性蛋白為PCT。采用細(xì)胞融合技術(shù)成功篩選出7株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,將其命名為B3,C4,C7,E9,F8,F10,G2。選B3和C4細(xì)胞株通過體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體,經(jīng)純化后純度可達(dá)95%以上。間接ELISA法檢測(cè)B3、C4抗體效價(jià)均可達(dá)10⁷,親和常數(shù)分別為5. 06×10⁸,7. 3×10⁸。結(jié)... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2019,29(03)

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 動(dòng)物和細(xì)胞株
    1.2 主要試劑和儀器
    1.3 PCT重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定
    1.4 雜交瘤細(xì)胞的制備
        1.4.1 動(dòng)物免疫
        1.4.2 制備飼養(yǎng)細(xì)胞
        1.4.3 細(xì)胞融合
    1.5 小鼠體內(nèi)誘生法制備PCT單克隆抗體
    1.6 單克隆抗體的純化
        1.6.1 辛酸硫酸銨法粗提抗體
        1.6.2 Protein G親和層析法純化
    1.7 單克隆抗體純度、效價(jià)、親和力分析
        1.7.1 純度
        1.7.2 間接ELISA法測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)
        1.7.3 間接ELISA法測(cè)定單克隆抗體的親和力
2 結(jié)果
    2.1 PCT重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定
    2.2 雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆
    2.3 單克隆抗體性質(zhì)的初步測(cè)定
        2.3.1 純度鑒定
        2.3.2 抗體效價(jià)測(cè)定
        2.3.3 抗體親和力測(cè)定
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]單個(gè)B細(xì)胞制備CRP單克隆抗體及其ELISA檢測(cè)體系的初步建立[J]. 林駿,山云,劉謙,王曉煒,王洪濤,劉堯.  中國(guó)免疫學(xué)雜志. 2019(01)
[2]降鈣素原的原核表達(dá)及鑒定[J]. 蔣棚俊,吳勝昔,王玲玲,李令臣,李俊萱,曾政,梁望旺,李志.  重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)). 2018(06)
[3]新型量子點(diǎn)免疫熒光層析法檢測(cè)降鈣素原試劑盒臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)[J]. 何國(guó)煒,黃建華,林秀梅,宋志興.  中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志. 2017(04)
[4]血清PCT、CRP及內(nèi)毒素在細(xì)菌性血流感染所致膿毒癥患者中的早期診斷價(jià)值[J]. 楊輝,羅倩,陳君灝,楊森,張玨.  現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2017(02)
[5]降鈣素原對(duì)全身炎癥反應(yīng)綜合征患者病情預(yù)后的判斷價(jià)值分析[J]. 李莉.  世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘. 2016(88)
[6]免疫透射比濁法檢測(cè)降鈣素原的方法學(xué)評(píng)價(jià)[J]. 胡孝彬,張夢(mèng)玲,曾靜,鄭凡.  實(shí)用醫(yī)技雜志. 2014(12)



本文編號(hào)：3182083