發(fā)布時(shí)間：2017-04-17 13:25

  本文關(guān)鍵詞：惡性瘧原蟲酸性鈣體的分離純化及其蛋白質(zhì)組學(xué)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的：瘧原蟲屬于真球蟲目,血孢子蟲亞目,瘧原蟲科,寄生于人體可以引起人類瘧疾。尤其是惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum),與75%的人類瘧疾有關(guān)[1],瘧疾流行于102個(gè)國(guó)家和地區(qū)導(dǎo)致4億人感染,雖然大多數(shù)患者能夠治愈,可是仍有100萬(wàn)人死亡,其中以兒童占了多數(shù)。至今我國(guó)仍有約15個(gè)省(自治區(qū))546個(gè)縣(市)近3億人口還在瘧疾威脅之中,南部惡性瘧病例增多,因此,瘧疾的防治在傳染性疾病中仍然居于重要地位[3]。以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法(ACT)是目前治療惡性瘧疾這一最致命的疾病形式最強(qiáng)有力的武器,其療效能達(dá)到90%以上[4,5],但近年來(lái)科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)少數(shù)惡性瘧原蟲對(duì)青蒿素、氯喹等藥物表現(xiàn)出抗藥性,在部分東南亞地區(qū)日益嚴(yán)重在柬埔寨和泰國(guó)邊境地區(qū)近期已確認(rèn)出現(xiàn)青蒿素耐藥性,這為瘧疾的防治工作敲響了警鐘。開(kāi)發(fā)抗瘧疾新藥不但至關(guān)重要而且面臨著急迫性。為了找到新的抗瘧藥物作用靶標(biāo),我們須進(jìn)一步研究瘧原蟲的結(jié)構(gòu)及其特性,以找到有效的藥物作用靶點(diǎn),為研究抗瘧新藥提供基礎(chǔ)。寄生蟲體內(nèi)許多特殊的細(xì)胞器是寄生蟲特有的,是宿主體內(nèi)不存在的,通過(guò)對(duì)這些細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究,就有可能發(fā)現(xiàn)針對(duì)這些寄生蟲的特異靶標(biāo)。近期研究發(fā)現(xiàn)并命名的一個(gè)新細(xì)胞器一酸性鈣體(Acidocalcisome, Ac)就是其中之一。酸性鈣體是一種特殊的細(xì)胞器,由美國(guó)伊利諾依大學(xué)Dr.Docampo Roberto教授的研究團(tuán)隊(duì)首先在錐蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn),因其富含鈣和磷酸鹽,呈酸性,故命名為酸性鈣體。隨后又在利什曼原蟲、弓形蟲、瘧原蟲、艾美原蟲、綠藻、霉菌、細(xì)菌、卵黃及人類血小板中均發(fā)現(xiàn)有該類細(xì)胞器的存在。相對(duì)于大家所熟知的細(xì)胞器,這種新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞器為我們研究抗瘧新藥提供了更大可能性。研究發(fā)現(xiàn),酸性鈣體的膜上有許多泵：如鈣泵(Ca2+-ATPase)、質(zhì)子泵(Vacuolar-H+-ATPase, Vacuolar-H+-pryophosphatase)、鈉/氫泵(Na+/H+ exchanger)、鈣/氫泵(Ca2+/H+ exchanger)和水蛋白通道(Aquaporin)、離子通道等。其中,液泡型質(zhì)子焦磷酸酶為酸性鈣體所特有,已被應(yīng)用為酸性鈣體分離純化及定位的標(biāo)志。這些蛋白為酸性鈣體的主要生理功能奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。酸性鈣體的主要功能有4個(gè)：儲(chǔ)存磷酸鹽,儲(chǔ)存陽(yáng)離子,調(diào)節(jié)pH值和調(diào)節(jié)滲透壓。這些成分對(duì)寄生蟲的毒性、代謝和入侵宿主具有非常重要的作用。在對(duì)寄生蟲酸性鈣體的研究中,以錐蟲和弓形蟲的研究最為深入,瘧原蟲中也已證實(shí)有酸性鈣體的存在[18-20],但對(duì)其研究遠(yuǎn)不如錐蟲和弓形蟲深入,其具體的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能和代謝特點(diǎn)尚未十分清楚。為了找到更多可作為抗瘧新藥靶標(biāo)的蛋白,我們需要對(duì)惡性瘧原蟲酸性鈣體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。研究方法與結(jié)果：用傳統(tǒng)方法從惡性瘧原蟲中分離、純化酸性鈣體非常困難。因?yàn)閻盒辕懺x體外培養(yǎng)時(shí),其生長(zhǎng)過(guò)程受血清影響很大,很難標(biāo)準(zhǔn)化,因此很難獲得足夠量的蟲體。本課題組在長(zhǎng)期的惡性瘧原蟲相關(guān)研究過(guò)程中,建立了利用AlbuMAXⅠ替代人血清培養(yǎng)惡性瘧原蟲的方法,體外連續(xù)培養(yǎng)紅細(xì)胞感染率最高可以達(dá)到40%。該方法已證明能滿足大規(guī)模分離、純化蟲體的需求,可提供充足的蟲源。在紅細(xì)胞感染率達(dá)到20%時(shí),收集蟲血,經(jīng)60%的Percoll分離純化感染紅細(xì)胞后,用皂素室溫條件下溫和裂解紅細(xì)胞,得到純化的惡性瘧原蟲滋養(yǎng)體和裂殖體。細(xì)胞裂解液配合碳化硅碾磨裂解蟲體之后,收集勻漿上清。本實(shí)驗(yàn)室在前期對(duì)伯氏瘧原蟲酸性鈣體進(jìn)行研究時(shí),摸索出適合分離純化伯氏瘧原蟲酸性鈣體的碘克沙醇密度梯度為15%、20%、25%、30%、34%和38%,相對(duì)離心力30000g。我們將相對(duì)離心力調(diào)整為50000g后,發(fā)現(xiàn)該梯度同樣適合惡性瘧原蟲酸性鈣體的提取,離心管內(nèi)溶液分為13層,酸性鈣體被富集于最底層沉淀中。將最底層沉淀重懸后進(jìn)行透射電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)其中含有豐富的大小不等的圓形電子致密顆粒,對(duì)純化的惡性瘧原蟲感染紅細(xì)胞樣本經(jīng)制片處理后進(jìn)行透射電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)蟲體中有散在分布的大小不等空泡或包涵體。這些均與前人文獻(xiàn)報(bào)道相符,由此認(rèn)為,本研究成功將惡性瘧原蟲酸性鈣體提取純化。將純化的惡性瘧原蟲酸性鈣體樣品裂解、濃縮、電泳后,割膠進(jìn)行液相色譜(LC-MS/MS)鑒定。通過(guò)Mascot2.3.02軟件對(duì)鑒定得到的肽段進(jìn)行分析比對(duì),,我們共得到283個(gè)鑒定蛋白質(zhì),其中77個(gè)為假想蛋白質(zhì),62個(gè)為惡性瘧原蟲保守蛋白,144個(gè)為已識(shí)別蛋白質(zhì)。對(duì)鑒定到的蛋白進(jìn)行GO功能分析注釋,我們發(fā)現(xiàn),在分子功能(Molecular Function)分類結(jié)果中,催化活性蛋白(catalytic activity)和結(jié)合活性蛋白(binding activity)占絕大多數(shù),分別為33.33%和55.56%；亞細(xì)胞定位(Cellular Component)結(jié)果顯示,16.67%的鑒定蛋白質(zhì)位于細(xì)胞器；參與生物進(jìn)程(Biological Process)分類結(jié)果顯示,16.47%鑒定蛋白質(zhì)主要參與新陳代謝過(guò)程(metabolic process)、16.47%參與細(xì)胞過(guò)程(cellular process)、12.50%參與單一生物過(guò)程(single-organism　process)、將鑒定到的蛋白質(zhì)和COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),預(yù)測(cè)這些蛋白質(zhì)大部分可能與能量生產(chǎn)及轉(zhuǎn)換(Energ production and conversion)、細(xì)胞內(nèi)交通、分泌及膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)(Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport)和預(yù)測(cè)一般功能(General function prediction only)有關(guān)。這些特征與酸性鈣體的四個(gè)主要功能相關(guān)。通過(guò)文獻(xiàn)檢索及生物學(xué)分析,最后初步預(yù)測(cè)液泡型質(zhì)子焦磷酸酶(V-PPase)、磷酸核糖焦磷酸合成酶、磷酸化型Ca2+ATP酶、ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白、小GTP結(jié)合蛋白sar1、鈣依賴性蛋白激酶4 (CDPK4)、14-3-3蛋白家族、水甘油通道蛋白(AQP)、液泡型質(zhì)子ATP酶、囊泡相關(guān)膜蛋白、磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶、液泡型ATP合成酶等17個(gè)蛋白質(zhì)可能定位于惡性瘧原蟲酸性鈣體。本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)伯氏瘧原蟲酸性鈣體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中,初步預(yù)測(cè)了水通道蛋白、CCR4相關(guān)因子16、鈣依賴性蛋白激酶4(CDPK4)、多重耐藥蛋白(MRP)、液泡型ATP合成酶亞單位(a,b,c,h,f)、磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶、磷脂酰肌-3酶、磷脂酶A2 (PLA2s)和液泡型質(zhì)子焦磷酸酶(V-PPase)等18個(gè)蛋白定位于酸性鈣體。因伯氏瘧原蟲跟惡性瘧原蟲在形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組成、生理特點(diǎn)、生長(zhǎng)周期等方面非常相似,因此,伯氏瘧原蟲酸性鈣體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)于本實(shí)驗(yàn)具有一定的指導(dǎo)意義。通過(guò)將惡性瘧原蟲酸性鈣體的17個(gè)預(yù)測(cè)蛋白和伯氏瘧原蟲酸性鈣體的18個(gè)預(yù)測(cè)蛋白進(jìn)行對(duì)比分析,我們發(fā)現(xiàn)了8個(gè)蛋白在惡性瘧原蟲和伯氏瘧原蟲酸性鈣體中均被預(yù)測(cè)有存在的可能。通過(guò)用ClustalW2對(duì)這8個(gè)蛋白進(jìn)行同源性比對(duì),發(fā)現(xiàn)其中有7個(gè)蛋白同源性較高,大于60%。大量閱讀相關(guān)文獻(xiàn)并綜合以上分析后,我們選擇惡性瘧原蟲水甘油通道蛋白(PfAQP)作進(jìn)一步的研究,同時(shí)我們需要惡性瘧原蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶(PfVP1)的抗體做共定位研究。因其二者跨膜區(qū)均較多,不易進(jìn)行原核表達(dá),多次嘗試均以失敗告終,故我們選擇利用合成肽與載體蛋白偶聯(lián)作抗原免疫小鼠的方法制備單克隆抗體。為了后續(xù)研究的開(kāi)展,我們將弓形蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶(TgVP1)的氨基酸序列與PfVP1作比對(duì),選擇其同源序列合成肽段制備單抗,PfAQP單抗制備則選擇PfAQP與伯氏瘧原蟲水通道蛋白(PbAQP)的同源肽段進(jìn)行合成。惡性瘧原蟲水通道蛋白(PfAQP)全長(zhǎng)258個(gè)氨基酸,大小約為28kDa,弓形蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶(TgVP1)全長(zhǎng)816個(gè)氨基酸,大小約為85kDa。針對(duì)PfAQP,經(jīng)過(guò)IEBD、BCPREDS Server 1.0、TMHMM Server v 2.0和同源性比對(duì)分析,我們?cè)赑fAQP的6個(gè)跨膜區(qū)之外選擇了與惡性瘧原蟲和伯氏瘧原蟲同源性較高的肽段,CPLVDLANNEKDGVDL,位于肽鏈全長(zhǎng)的C端243～258個(gè)氨基酸。用這種方法我們最終獲得2C3和6H10兩株單抗,這兩株單抗不僅能與人工合成的多肽反應(yīng),而且可以識(shí)別天然惡性瘧原蟲蛋白中的27kDa大小蛋白,與PfAQP預(yù)測(cè)大小及文獻(xiàn)報(bào)道相符[37]。而針對(duì)TgVPl,我們利用IEBD、TMHMM Server v 2.0和同源性比對(duì)分析后,選擇了其17個(gè)跨膜區(qū)外并與瘧原蟲同源性較高的肽段,用這種方法我們最終獲得單抗1D7-H11、3A6-E4和3G6-F9,這3株單抗均可以識(shí)別天然弓形蟲全蛋白中85kDa大小和惡性瘧原蟲全蛋白中76kDa大小蛋白。進(jìn)行免疫熒光鑒定時(shí),以上5株單抗均能產(chǎn)生特異性熒光,但PfAQP與TgVPl的熒光能否共定位仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)論：本研究建立了AlbuMAX I替代人血清體外連續(xù)培養(yǎng)惡性瘧原蟲的方法,收集到足夠蟲體,成功分離純化出惡性瘧原蟲酸性鈣體并進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析,鑒定獲得283個(gè)蛋白質(zhì),經(jīng)系統(tǒng)生物信息學(xué)分析初步預(yù)測(cè)有17個(gè)蛋白質(zhì)可能定位于惡性瘧原蟲酸性鈣體,并成功制備了2株惡性瘧原蟲水甘油通道蛋白抗體和3株弓形蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶抗體,經(jīng)鑒定,這5株抗體均可與目的蛋白特異性結(jié)合,且抗弓形蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶抗體可與惡性瘧原蟲液泡型質(zhì)子焦磷酸酶特異性結(jié)合。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為惡性瘧原蟲酸性鈣體的相關(guān)研究及抗瘧新藥作用靶標(biāo)的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：惡性瘧原蟲 酸性鈣體 蛋白質(zhì)組學(xué) lc-ms/ms 單克隆抗體 免疫熒光
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R382
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-20
• 第一章 惡性瘧原蟲的復(fù)蘇、體外培養(yǎng)及分離純化20-29
• 1. 材料20-24
• 2. 方法24-26
• 3. 結(jié)果26-28
• 4. 小結(jié)28-29
• 第二章 惡性瘧原蟲酸性鈣體的純化提取和電鏡觀察29-37
• 1. 材料29-31
• 2. 方法31-34
• 3. 結(jié)果34-36
• 4. 小結(jié)36-37
• 第三章 惡性瘧原蟲酸性鈣體蛋白質(zhì)組學(xué)分析37-45
• 1. 材料37-38
• 2. 方法38-41
• 3. 結(jié)果41-44
• 4. 小結(jié)44-45
• 第四章 惡性瘧原蟲酸性鈣體相關(guān)蛋白單克隆抗體的制備及鑒定45-66
• 1. 材料45-49
• 2. 方法49-56
• 3. 結(jié)果56-64
• 4. 小結(jié)64-66
• 討論66-74
• 參考文獻(xiàn)74-81
• 英文縮寫詞81-83
• 碩士期間科研成果83-84
• 致謝84-85

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 車河龍;林棟;;瘧疾的防控現(xiàn)狀及進(jìn)展[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2010年02期

  本文關(guān)鍵詞：惡性瘧原蟲酸性鈣體的分離純化及其蛋白質(zhì)組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：313332