鈣離子是重要的第二信使，在細(xì)胞生長、分化過程中起著重要的作用，Ca²⁺／CAM可磷酸化多種酶，其中鈣離子／鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是其重要靶分子。CaMKⅡ是一種多功能的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，廣泛分布表達(dá)于多種器官組織，可在體內(nèi)磷酸化40多種具有重要生理功能的蛋白分子包括酶、離子通道、轉(zhuǎn)錄因子等等：CaMKⅡ可以調(diào)控碳水化合物、氨基酸、脂肪的代謝，神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞骨架的構(gòu)建，細(xì)胞周期的進(jìn)程，DNA損傷的修復(fù)等等生理病理過程。近年來有些研究結(jié)果提示CaMKⅡ在細(xì)胞的生長、分化過程中起著十分重要的作用，也有人認(rèn)為CaMKⅡ是細(xì)胞周期順利進(jìn)行的必需分子。 CaMKⅡ抑制劑的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用是研究CaMKⅡ生理功能的有效途徑。CaMKⅡ抑制劑可通過與Ca²⁺／CAM結(jié)合位點(diǎn)的相互結(jié)合或影響催化功能來抑制CaMKⅡ的活性，從而阻斷CaMKⅡ?qū)ζ涞孜锏牧姿峄蛘{(diào)節(jié)某些基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死、生長阻滯，該方面研究可為臨床腫瘤治療提供新的策略和方向。因此，發(fā)現(xiàn)新型CaMKⅡ抑制劑是一項(xiàng)很有理論探索意義和... 

【文章來源】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)上海市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

hCaMKI州a與其它CaMKH抑制蛋白的同源分析

2.5人hcaMKllNa的細(xì)胞與組織分布利用Rl’-PCR方法對(duì)14種人造血腫瘤細(xì)胞系及實(shí)體腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行了hCaMKllNamRNA表達(dá)的檢測。結(jié)果如圖1一5所示。造血系腫瘤細(xì)胞中，在B淋巴瘤細(xì)胞Daudi、非T非B型急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Reh、組細(xì)胞白血病U937、慢性髓系白血病細(xì)胞K562等細(xì)胞中檢測到了hCaMKllNamRNA的表達(dá)，其中Reh細(xì)胞表達(dá)量較高，而急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞NB4和T淋巴瘤細(xì)胞MOLT-4中未見表達(dá)。在實(shí)體腫瘤細(xì)胞中，宮頸癌HeLa、乳腺癌MCF一7、前列腺癌PC一3細(xì)胞、腦膠質(zhì)瘤A172、肝癌SMMC7721、肺癌A549、卵巢癌CaoV-3等細(xì)胞均以不同程度表達(dá)hCaMKllNamRNA，其中在HeLa、MCF一7和PC一3細(xì)胞中表達(dá)量較高。而LoVc和HT-29兩種人結(jié)腸腺癌細(xì)胞未見hCaMKI取a表達(dá)。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們選擇了人結(jié)腸腺癌LoVo細(xì)胞，利用基因轉(zhuǎn)染和瘤體內(nèi)電脈沖導(dǎo)入等方法進(jìn)行體外及體內(nèi)hCaMKllNa生物學(xué)功能的研究。圖1一5腫瘤細(xì)胞中CaMKIma表達(dá)?

2一3PhysiealmapofexPressionPeDNA3.1/His一Mye(一)BveetorheaMKllNaPCR產(chǎn)物純化后經(jīng)刀口陰Hl/關(guān){indlll雙酶切與peDNA3.l/mye一hisCB)載體(質(zhì)粒圖譜見圖2一3)，按常規(guī)方法重組并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌DH5a(氯化鈣法)。挑取克隆進(jìn)行鑒定、純化并測序。測序正確克隆分別記為peDNA一KHNa、pe惻A一KllNal二;、penNA一KllNal.53、penNA一KllNal一65。真核表達(dá)載體的構(gòu)建過程見圖2一4。1.4hCaMKllNa重組GST融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化挑表達(dá)陽性的pGEx一KllNa、pGEX一KlxNar碑l、poEx一KllNa卜53、pGEX一KllNal一65和pGEX一27peptide的BLZI克隆，接種于1oomlLB培養(yǎng)基中，37oC250rPm/min振蕩培養(yǎng)12一15hr，以l:100轉(zhuǎn)接于200mlLB振蕩培養(yǎng)，待細(xì)菌生長至對(duì)數(shù)生長期，加loomMIPTo至o.ZmM后300e誘導(dǎo)2一6hr，5


本文編號(hào)：3123975