目的 本研究用逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chainreaction簡稱RT-PCR）的方法獲得S100B基因，構建表達S100B蛋白的重組質粒，使之高效表達S100B蛋白。研究表達蛋白質的生物學活性，并通過親和層析的方法純化融合蛋白，為S100B作用機制和應用研究奠定基礎。 方法 應用RT-PCR的方法獲得S100B基因，插入克隆載體，鑒定重組質粒并進行基因序列測定和分析；純化S100B基因片段并插入原核表達載體，誘導表達目的蛋白，鑒定融合蛋白S100B蛋白-麥芽糖結合蛋白（S100B-MBP蛋白，簡稱MBS）。利用親和層析方法純化MBS蛋白；獲得融合蛋白的免疫血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清S100B抗體效價，蛋白印跡法（Western blot）檢驗融合蛋白的生物學活性。 結果 1、含S100B基因的重組質粒S100B-pMD 18T vector（簡稱pTS），經(jīng)雙酶切后和特異PCR，證實S100B基因的重組克隆質粒構建成功。經(jīng)測序，S100B基因全長320bp。GenBan... 

【文章來源】：鄭州大學河南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
S100B基因的克隆、原核表達及生物學活性研究
    前言
    研究總技術線路
    實驗材料
        1 常用生化試劑
        2 主要儀器設備
        3 質粒與菌株
        4 培養(yǎng)基及常用溶液的配制
    實驗方法
        1 S100B基因克隆與序列分析
            1.1 S100B基因克隆技術路線
            1.2 S100B基因重組質粒構建示意圖
            1.3 組織總RNA提取
            1.4 引物的設計與合成
            1.5 RT-PCR擴增
            1.6 PCR產(chǎn)物DNA片段回收
            1.7 感受態(tài)細胞的制備
            1.8 質粒重組及鑒定
            1.9 S100B克隆基因序列測定
            1.10 序列的比較分析
        2 MBS融合蛋白在原核表達載體pMAL-c2x中的表達
            2.1 技術路線
            2.2 pTS融合基因與pMAL-c2x的重組質粒構建示意圖
            2.3 表達融合蛋白重組質粒pMAL-S100B的構建過程
            2.4 融合蛋白MBS的表達
            2.5 融合蛋白誘導表達條件的優(yōu)化
            2.6 SDS-PAGE電泳
            2.7 Western blot（蛋白印跡法）
            2.8 TB1（pMS）的大量誘導表達
            2.9 融合蛋白在細胞內的定位（即可溶性分析）
            2.10 融合蛋白MBS的純化
            2.11 融合蛋白MBS免疫兔血清的制備
            2.12 ELISA法檢測兔血清效價
    結果與分析
        1 S100B基因的克隆與同源性分析
            1.1 組織和細胞總RNA提取
            1.2 S100B基因RT-PCR擴增結果
            1.3 S100B基因的克隆及鑒定
        2 融合蛋白MBS在TB1（pMS）中的表達
            2.1 重組質粒pMS的構建及鑒定
            2.2 融合蛋白MBS的誘導表達結果
            2.3 Western blot鑒定融合蛋白MBS
            2.4 表達蛋白可溶性分析結果
            2.5 融合蛋白pMS在TB1（pMS）中表達條件的優(yōu)化
            2.6 融合蛋白MBS親和層析純化結果
        3 融合蛋白MBS的生物學活性檢測
            3.1 免疫血清的制備及血清效價測定
            3.2 免疫兔血清抗體成分分析
討論
結論
參考文獻
綜述
英文略縮詞
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]含PRPL啟動子的原核高效表達載體的組建及其應用[J]. 張智清,姚立紅,侯云德.  病毒學報. 1990(02)



本文編號：3123974