發(fā)布時(shí)間：2021-04-07 18:32

　　目的 本研究用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chainreaction簡(jiǎn)稱(chēng)RT-PCR）的方法獲得S100B基因，構(gòu)建表達(dá)S100B蛋白的重組質(zhì)粒，使之高效表達(dá)S100B蛋白。研究表達(dá)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，并通過(guò)親和層析的方法純化融合蛋白，為S100B作用機(jī)制和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。 方法 應(yīng)用RT-PCR的方法獲得S100B基因，插入克隆載體，鑒定重組質(zhì)粒并進(jìn)行基因序列測(cè)定和分析；純化S100B基因片段并插入原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，鑒定融合蛋白S100B蛋白-麥芽糖結(jié)合蛋白（S100B-MBP蛋白，簡(jiǎn)稱(chēng)MBS）。利用親和層析方法純化MBS蛋白；獲得融合蛋白的免疫血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)血清S100B抗體效價(jià)，蛋白印跡法（Western blot）檢驗(yàn)融合蛋白的生物學(xué)活性。 結(jié)果 1、含S100B基因的重組質(zhì)粒S100B-pMD 18T vector（簡(jiǎn)稱(chēng)pTS），經(jīng)雙酶切后和特異PCR，證實(shí)S100B基因的重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)測(cè)序，S100B基因全長(zhǎng)320bp。GenBan... 

【文章來(lái)源】：鄭州大學(xué)河南省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
S100B基因的克隆、原核表達(dá)及生物學(xué)活性研究
    前言
    研究總技術(shù)線路
    實(shí)驗(yàn)材料
        1 常用生化試劑
        2 主要儀器設(shè)備
        3 質(zhì)粒與菌株
        4 培養(yǎng)基及常用溶液的配制
    實(shí)驗(yàn)方法
        1 S100B基因克隆與序列分析
            1.1 S100B基因克隆技術(shù)路線
            1.2 S100B基因重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖
            1.3 組織總RNA提取
            1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成
            1.5 RT-PCR擴(kuò)增
            1.6 PCR產(chǎn)物DNA片段回收
            1.7 感受態(tài)細(xì)胞的制備
            1.8 質(zhì)粒重組及鑒定
            1.9 S100B克隆基因序列測(cè)定
            1.10 序列的比較分析
        2 MBS融合蛋白在原核表達(dá)載體pMAL-c2x中的表達(dá)
            2.1 技術(shù)路線
            2.2 pTS融合基因與pMAL-c2x的重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖
            2.3 表達(dá)融合蛋白重組質(zhì)粒pMAL-S100B的構(gòu)建過(guò)程
            2.4 融合蛋白MBS的表達(dá)
            2.5 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
            2.6 SDS-PAGE電泳
            2.7 Western blot（蛋白印跡法）
            2.8 TB1（pMS）的大量誘導(dǎo)表達(dá)
            2.9 融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位（即可溶性分析）
            2.10 融合蛋白MBS的純化
            2.11 融合蛋白MBS免疫兔血清的制備
            2.12 ELISA法檢測(cè)兔血清效價(jià)
    結(jié)果與分析
        1 S100B基因的克隆與同源性分析
            1.1 組織和細(xì)胞總RNA提取
            1.2 S100B基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果
            1.3 S100B基因的克隆及鑒定
        2 融合蛋白MBS在TB1（pMS）中的表達(dá)
            2.1 重組質(zhì)粒pMS的構(gòu)建及鑒定
            2.2 融合蛋白MBS的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果
            2.3 Western blot鑒定融合蛋白MBS
            2.4 表達(dá)蛋白可溶性分析結(jié)果
            2.5 融合蛋白pMS在TB1（pMS）中表達(dá)條件的優(yōu)化
            2.6 融合蛋白MBS親和層析純化結(jié)果
        3 融合蛋白MBS的生物學(xué)活性檢測(cè)
            3.1 免疫血清的制備及血清效價(jià)測(cè)定
            3.2 免疫兔血清抗體成分分析
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
英文略縮詞
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]含PRPL啟動(dòng)子的原核高效表達(dá)載體的組建及其應(yīng)用[J]. 張智清,姚立紅,侯云德.  病毒學(xué)報(bào). 1990(02)



本文編號(hào)：3123974