目的:通過觀察缺氧預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及鋅指核轉(zhuǎn)錄因子ZFP580表達(dá)的改變,探討ZFP580的作用及機(jī)制。方法:培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞,分為3組:（1）缺氧/復(fù)氧（H/R）組:H9c2心肌細(xì)胞換用模擬缺血溶液（pH=6.2）缺氧（95%N2+5%CO2）培養(yǎng)3 h,復(fù)氧培養(yǎng)2 h;（2）缺氧預(yù)適應(yīng)（HPC）組:H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)3個(gè)循環(huán)的短暫缺氧（10 min）/復(fù)氧（20 min）處理后,進(jìn)行同上H/R實(shí)驗(yàn);（3）對(duì)照（C）組:正常培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞。通過MTT染色及LDH水平判定HPC的作用。Western blotting方法觀察心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子ZFP580表達(dá)及ERK1/2磷酸化情況,以及ERK1/2磷酸化抑制劑PD98059對(duì)ZFP580表達(dá)的影響。分別構(gòu)建高/低表達(dá)ZFP580的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞,經(jīng)H/R實(shí)驗(yàn)后利用Annexin V-PE/7-AAD染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡情況,Western bloting方法觀察caspase-3活化情況。結(jié)果:HPC能顯著改善H/R處理后H9c2心肌細(xì)胞存活率降低和LDH漏出的... 

【文章來源】：中國病理生理雜志. 2014,30(09)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

HPC對(duì)H/Ｒ處理后心肌細(xì)胞中ZFP580表達(dá)及EＲK1/2磷酸化的影響

ing方法驗(yàn)證，慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染能明顯改變H9c2心肌細(xì)胞中ZFP580的表達(dá)水平，見圖4A。轉(zhuǎn)染Lenti-ZFP580使ZFP580高表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞在H/Ｒ損傷后，心肌細(xì)胞中活化caspase-3表達(dá)下降，明顯低于轉(zhuǎn)染Lenti-NC的陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染Lenti-siＲNA使ZFP580低表達(dá)或不表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞在H/Ｒ損傷后，心肌細(xì)胞中活化caspase-3表達(dá)上升，明顯高于ZFP580高表達(dá)組及陰性對(duì)照組，見圖4B。Figure3．EffectsofPD98059onHPC-inducedZFP580expres-sion．Mean±SD．n=6．*P＜0．05vsDMSOalone;#P＜0．05vsHPC+H/Ｒ+DMSO．圖3PD98059對(duì)HPC處理后ZFP580表達(dá)的影響Figure4．Lentivirus-mediatedtransfectionofZFP580(A)affectedH/Ｒ-inducedcaspase-3activation(B)inH9c2cells．Mean±SD．n=6．*P＜0．05vsLenti-NCgroup．圖4慢病毒介導(dǎo)的ZFP580基因轉(zhuǎn)染對(duì)H/Ｒ處理后caspase-3表達(dá)的影響5AnnexinV-PE/7-AAD染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)染不同慢病毒載體的H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)H/Ｒ處理后，流式細(xì)胞儀均可檢測(cè)到凋亡細(xì)胞。轉(zhuǎn)染Lenti-ZFP580后高表達(dá)ZFP580的H9c2心肌細(xì)胞在H/Ｒ損傷后細(xì)胞凋亡率明顯低于轉(zhuǎn)染Lenti-NC的陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染Lenti-siＲNA后低表達(dá)或不表達(dá)ZFP580的H9c2心肌細(xì)胞在H/Ｒ損傷后細(xì)胞凋亡率升高，明顯高于ZFP580高表達(dá)組及陰性對(duì)照組，見圖5。討論缺氧預(yù)處理能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)缺血、缺氧、缺血/再灌注等損傷的耐受性，然而其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制尚未完全闡明。有研究認(rèn)為HPC的保護(hù)機(jī)制與其引起的大量?jī)?nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的釋放有關(guān)，如腺苷、氧自由基清除酶、緩激肽及多種保護(hù)蛋白均被證實(shí)參與了HPC的保護(hù)作用［8-9］。然而，從細(xì)胞感受細(xì)胞外的缺氧信號(hào)，并將信號(hào)傳至胞內(nèi)，最終引起內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的釋放，其中必然存在復(fù)?

3PD98059對(duì)HPC處理后ZFP580表達(dá)的影響H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)PD98059預(yù)處理1h后進(jìn)行HPC及H/Ｒ實(shí)驗(yàn)，Westernblotting結(jié)果顯示PD98059預(yù)處理明顯抑制HPC誘導(dǎo)的ZFP580的表達(dá)上調(diào)，而DMSO對(duì)照組細(xì)胞ZFP580在HPC及H/Ｒ后表達(dá)未受影響，見圖3。4慢病毒介導(dǎo)ZFP580基因轉(zhuǎn)染對(duì)H/Ｒ處理后caspase-3表達(dá)的影響經(jīng)Westernblotting方法驗(yàn)證，慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染能明顯改變H9c2心肌細(xì)胞中ZFP580的表達(dá)水平，見圖4A。轉(zhuǎn)染Lenti-ZFP580使ZFP580高表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞在H/Ｒ損傷后，心肌細(xì)胞中活化caspase-3表達(dá)下降，明顯低于轉(zhuǎn)染Lenti-NC的陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染Lenti-siＲNA使ZFP580低表達(dá)或不表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞在H/Ｒ損傷后，心肌細(xì)胞中活化caspase-3表達(dá)上升，明顯高于ZFP580高表達(dá)組及陰性對(duì)照組，見圖4B。Figure3．EffectsofPD98059onHPC-inducedZFP580expres-sion．Mean±SD．n=6．*P＜0．05vsDMSOalone;#P＜0．05vsHPC+H/Ｒ+DMSO．圖3PD98059對(duì)HPC處理后ZFP580表達(dá)的影響Figure4．Lentivirus-mediatedtransfectionofZFP580(A)affectedH/Ｒ-inducedcaspase-3activation(B)inH9c2cells．Mean±SD．n=6．*P＜0．05vsLenti-NCgroup．圖4慢病毒介導(dǎo)的ZFP580基因轉(zhuǎn)染對(duì)H/Ｒ處理后caspase-3表達(dá)的影響5AnnexinV-PE/7-AAD染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)染不同慢病毒載體的H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)H/Ｒ處理后，流式細(xì)胞儀均可檢測(cè)到凋亡細(xì)胞。轉(zhuǎn)染Lenti-ZFP580后高表達(dá)ZFP580的H9c2心肌細(xì)胞在H/Ｒ損傷后細(xì)胞凋亡率明顯低于轉(zhuǎn)染Lenti-NC的陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染Lenti-siＲNA后低表達(dá)或不表達(dá)ZFP580的H9c2心肌細(xì)胞在H/Ｒ損傷后細(xì)胞凋亡率升高，明顯高于ZFP580高表達(dá)組及陰性對(duì)照組，見圖5。討論缺氧預(yù)處理能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)缺血、缺氧、缺血/再灌注等損傷的耐受

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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