目的:初步探討精子相關(guān)抗原6（SPAG6）在小鼠精子發(fā)生過程中頂體形成階段的表達及其調(diào)控作用。方法:采用Western印跡檢測出生后小鼠睪丸發(fā)育不同階段（第8、12、16、20、24、28、30、35天）中SPAG6的表達;免疫熒光觀察SPAG6在生精細胞中的定位;分別構(gòu)建SPAG6和SPINK2蛋白表達質(zhì)粒,以AH109和CHO細胞為對象,采用酵母雙雜交及細胞內(nèi)共定位實驗檢測SPAG6與SPINK2蛋白間相互作用;免疫熒光檢測SPINK2在SPAG6基因敲除（KO）小鼠的睪丸生精細胞中的表達與定位。結(jié)果:小鼠出生后第16～28天,SPAG6表達顯著升高,且定位于圓形精子細胞的頂體;酵母雙雜交實驗顯示SPAG6/SPINK2組能在選擇性培養(yǎng)基（SD/-Leu/-Trp/-His）中生長;CHO細胞共轉(zhuǎn)染SPAG6和SPINK2表達質(zhì)粒時,SPAG6與SPINK2共定位在細胞核周圍;SPAG6 KO小鼠睪丸生精細胞中未檢測到SPINK2表達及定位于精子頂體。結(jié)論:SPAG6與SPINK2形成蛋白復合體,并可能通過調(diào)控SPINK2的穩(wěn)定表達參與精子頂體形成。 

【文章來源】：中華男科學雜志. 2019,25(03)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

SPAG6在小鼠第一波精子發(fā)生過程的表達Figure1．ExpressionofSPAG6duringthefirstwaveofspermatogenesisofthemiceondifferentpostnataldays(PN)

圖1SPAG6在小鼠第一波精子發(fā)生過程的表達Figure1．ExpressionofSPAG6duringthefirstwaveofspermatogenesisofthemiceondifferentpostnataldays(PN)圖2SPAG6定位于圓形精子細胞的頂體凝集素:精子頂體熒光標記(綠色);DAPI染色標記DNA(藍色)Figure2．LocalizationofSPAG6intheacrosomeoftheroundspermatidsGreenindicatesLectinandblueindicatesDAPI．2．3SPAG6與SPINK2蛋白發(fā)生相互作用構(gòu)建pGBKT7/SPAG6和pGADT7/SPINK2重組質(zhì)粒并采用直接酵母雙雜交實驗驗證SPAG6與SPINK2相互作用。如圖3結(jié)果所示，AH109菌株共轉(zhuǎn)染了含pGADT7和pGBKT7載體能夠在SD培養(yǎng)基同時缺少亮氨酸(-Leu)和色氨酸(-Trp)的平板上生長，但是不能在SD培養(yǎng)基同時缺少亮氨酸(-Leu)、色氨酸(-Trp)和組氨酸(-His)的平板上生長。同陽性對照組pGADT7/IgT+pGBKT7/p53一樣，pGADT7/SPINK2+pGBKT7/SPAG6配對實驗組能在非選擇性(SD/-Leu/-Trp)和選擇性培養(yǎng)基(SD/-Leu/-Trp/-His)中均有生長(圖3A)。此外，構(gòu)建蛋白表達質(zhì)粒pTarget/SPAG6和pEGFP-N2/SPINK2共轉(zhuǎn)染到CHO細胞，免疫熒光染色顯示，單獨轉(zhuǎn)染pTarget/SPAG6或pEGFP-N2/SPINK2時，SPAG6和SPINK2分散在細胞質(zhì)(圖3Bb，3Bd)，當SPAG6與SPINK2共轉(zhuǎn)染時，SPAG6與SPINK2共定位在細胞核周圍(圖3Bh)，表明SPAG6和SPINK2發(fā)生相互作用。2．4SPAG6缺失對小鼠睪丸生精細胞中SPINK2蛋白表達的影響免疫熒光檢測顯示，SPINK2定位于野生型小鼠生精細胞頂體，而SPAG6KO小鼠生精細胞中未檢測到SPINK2和凝集素表達(圖4)，可能導

圖4SPAG6缺失對小鼠睪丸生精細胞中SPINK2蛋白表達的影響凝集素:精子頂體熒光標記(綠色);DAPI染色標記DNA(藍色)Figure4．ExpressionoftheSPINK2proteininthetesticulargermcellsoftheSPAG6-knockout(KO)mouseGreenindicatesLectinandblueindicatesDAPI．3討論哺乳動物SPAG6最初被證明是維持精子鞭毛中心軸絲結(jié)構(gòu)完整和調(diào)節(jié)精子鞭毛運動的重要蛋白［2］。研究SPAG6在第一波精子發(fā)生中的表達情況發(fā)現(xiàn)，在小鼠出生后第16～28天(即圓形精子期和伸長期［17-18］)，該蛋白表達量顯著升高。而且，SPAG6定位于圓形精子的頂體。這些結(jié)果提示，SPAG6不僅調(diào)節(jié)精子鞭毛的擺動，而且可能調(diào)控精子發(fā)生過程。為了進一步研究SPAG6在精子發(fā)生中的作用，本課題組采用酵母雙雜交篩選小鼠cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)SPINK2可能與SPAG6相互結(jié)合。通過直接酵母雙雜交和細胞內(nèi)共定位實驗證實這兩種蛋白能發(fā)生相互作用。SPINK2蛋白僅在小鼠睪丸及附睪組織中表達，并定位于圓形精子細胞的頂體囊泡和成熟精子的頂體［15，19］。研究SPINK2基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，該蛋白缺失促使頂體酶原異�；罨�，過早釋放頂體素，引起圓形精子細胞內(nèi)高爾基體碎裂，前頂體顆粒(proacrosomalgranule)不能融合成頂體囊泡(acroso-malvesicle)，導致頂體形成受阻，生精細胞分化停滯在圓形精子細胞階段，進而引起雄性不育［14］。結(jié)果表明SPINK2蛋白參與精子頂體形成，在精子變形期起著重要作用。泛素-蛋白酶體途徑是細胞內(nèi)一種蛋白質(zhì)降解調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在精子變形階段的核小體重塑、頂體生物合成及精子尾部形成等過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［

【參考文獻】：
期刊論文
[1]溶質(zhì)載體家族22成員14和精子相關(guān)抗原6在特發(fā)性弱精子癥患者精子中的表達[J]. 侯方圓,李玉山,楊夕陽,王全先,劉軍杰,王琳凱,蘇彥華,孫琳.  中華男科學雜志. 2017(08)
[2]泛素?蛋白酶體途徑在精子生成中的作用[J]. 董蓮花,冉茂良,李智,彭馥芝,陳斌.  遺傳. 2016(09)
[3]不孕不育癥的實驗室研究進展[J]. 徐文莉,李康,羅藝.  檢驗醫(yī)學與臨床. 2012(16)



本文編號：3096184