本文關鍵詞：A型肉毒素重鏈拮抗髓磷脂相關糖蛋白抑制Neuro-2a神經(jīng)細胞突起生長的實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1.體外實驗觀察髓磷脂相關糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)對Neuro-2a細胞神經(jīng)突起生長的抑制作用及對相關細胞內信號通路Rho A/ROCK的影響。2.觀察A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素重鏈(botulinum neurotoxin serotype-A heavy chain,Bo NT/A HC)對Neuro-2a細胞的促神經(jīng)突起再生作用并探討相關的細胞內信號機制。3.探討B(tài)o NT/A HC是否能夠拮抗MAG對神經(jīng)突起生長的抑制作用。方法:1.采用免疫熒光染色檢測Neuro-2a細胞MAG特異性受體NgR的表達,確定外源性MAG可以干預Neuro-2a細胞的必備結構基礎。在此基礎上,將外源性MAG加入培養(yǎng)液內,于不同時間點收集細胞觀察MAG在Neuro-2a細胞中的分布特征以確定NgR的激活。然后在培養(yǎng)液中加入不同濃度的MAG,24 h、48 h、72 h后收集細胞經(jīng)bIII-tubulin免疫熒光染色后,在熒光倒置顯微鏡下觀察并攝取圖像。每個濃度組、每個時間點均設定6個孔,在高倍鏡下(40X)每孔隨機攝取圖片4張,每組共計攝取圖片24張,在圖片上進行細胞突起長度及有突起細胞占圖片上所有細胞的百分比的測定。隨后,選擇最低有效濃度的MAG作為處理劑量加入細胞培養(yǎng)液,于不同時間點收集全細胞蛋白進行Rho A活性的測定及ROCK磷酸化的檢測。2.細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的BoNT/A HC進行干預,按上述方法進行分組設孔,于24 h、48 h、72 h后收集細胞進行bIII-tubulin的免疫熒光染色并攝取圖像,對細胞突起長度及有突起細胞占圖片上所有細胞的百分比進行計算,確定重鏈的最佳促神經(jīng)突起生長作用濃度;隨后,以最有效BoNT/A HC濃度作為處理劑量加入細胞培養(yǎng)液,同時,于Bo NT/A HC作用后不同時間點收集全細胞蛋白采用SDS-PAGE/Western-blot檢測ERK1/2及Akt的磷酸化改變。3.基于上述,1noml/LBo NT/A HC和20nmol/LMAG為實驗劑量,以三種不同方式將其加入細胞培養(yǎng)液:1)加入bont/ahc1h后再加入mag;2)加入mag后1h再加入bont/ahc;3)將mag與bont/ahc同時加入培養(yǎng)液內。分別于上述不同方式加入mag和bont/ahc后24h、48h、72h收集細胞進行biii-tubulin免疫熒光染色以觀察細胞突起生長的變化。于此同時,選擇同樣的處理方式作用于細胞10min、15min、1h、2h收集全細胞蛋白,采用sds-page及western-blot檢測rock、erk1/2及akt的磷酸化。結果:1.免疫熒光顯示:1)neuro-2a細胞表達ngr;2)外源性給予mag后1h可見neuro-2a細胞內出現(xiàn)mag的強陽性染色,提示外源性mag可以通過與ngr的結合內吞入胞;3)培養(yǎng)液內加入mag使neuro-2a細胞突起生長抑制,表現(xiàn)為突起長度顯著低于對照組(p0.05),有突起細胞占圖片上所有細胞的百分比也較對照組減少(p0.05);4)sds-page/western-blot結果顯示:培養(yǎng)液內加入20nmol/lmag后5min、10min、20min,neuro-2a細胞內rhoa活性均較對照組增強,差異有統(tǒng)計學顯著性(p0.05),于此同時,rock的磷酸化也較對照組增強(p0.05)。2.單純向培養(yǎng)液內加入不同濃度的bont/ahc時(0.1nmol/l、1nmol/l、10nmol/l),細胞突起的長度及有突起細胞的百分比與對照組相比皆明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),其中1nmol/l效果最顯著;同時,細胞培養(yǎng)液內加入1nmol/l的bont/ahc,分別于15min、30min、60min、90min、2h、3h、4h、5h時檢測erk1/2的磷酸化,于15min、30min、60min、120min時檢測akt的磷酸化。當bont/ahc作用60min后,erk1/2磷酸化水平較對照組開始增加,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05);當bont/ahc作用15min和60min時,akt的磷酸化水平增加,與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。3.當以上述三種不同的方式將1nmol/l的bont/ahc和20nmol/l的mag加入neuro-2a細胞培養(yǎng)液后發(fā)現(xiàn):24h、48h、72h后細胞突起長度及有突起細胞百分比與對照組相比差異無統(tǒng)計學顯著性(p0.05);三種處理方式作用于細胞10min、15min后檢測rock及akt的磷酸化與對照組比較無顯著性差異(p0.05),作用1h、2h后檢測erk1/2的磷酸化也無顯著性差異(p0.05)。結論:1.Neuro-2a細胞表達NgR。外源性給予MAG可激活NgR介導的神經(jīng)生長抑制信號通路(Rho A-ROCK),抑制神經(jīng)突起生長。2.小劑量Bo NT/A HC可以促進Neuro-2a細胞突起生長,并可促進再生相關的信號蛋白ERK1/2和Akt的磷酸化。3.Bo NT/A HC可以拮抗MAG引起的神經(jīng)生長抑制作用。
【關鍵詞】：A型肉毒素重鏈(BoNT/A HC) 髓磷脂相關糖蛋白(MAG) Neuro-2a細胞株 神經(jīng)生長抑制 神經(jīng)突起再生
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R338
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分 外源性髓磷脂相關糖蛋白抑制Neuro-2a細胞神經(jīng)突起生長的實驗觀察14-31
• 1 材料與方法14-25
• 1.1 材料14-18
• 1.2 方法18-25
• 2 結果25-31
• 2.1 Neuro-2a細胞表達Nogo受體(Nogo Receptor,NgR)25
• 2.2 MAG的時間梯度熒光強度變化25-26
• 2.3 MAG對Neuro-2a細胞神經(jīng)突起生長的影響26-28
• 2.4 外源性加入MAG增強Neuro-2a細胞Rho A活性28-29
• 2.5 外源性加入MAG促進ROCK磷酸化29-31
• 第二部分 A型肉毒素重鏈對Neuro-2a細胞的促神經(jīng)突起再生作用31-41
• 1 材料與方法31-35
• 1.1 材料31-32
• 1.2 方法32-35
• 2 結果35-41
• 2.1 A型肉毒素重鏈對Neuro-2a細胞突起生長的影響35-36
• 2.2 Bo NT/A HC刺激Neuo-2a細胞生成突起36-37
• 2.3 Bo NT/A HC促進Neuro-2a細胞中信號蛋白ERK1/2 的磷酸化37-39
• 2.4 Bo NT/A HC促進Neuro-2a細胞中信號蛋白Akt/PKB的磷酸化39-41
• 第三部分 BoNT/A HC拮抗MAG之神經(jīng)突起生長抑制作用41-50
• 1 材料與方法41-44
• 1.1 材料41-42
• 1.2 方法42-44
• 2 結果44-50
• 2.1 Bo NT/A HC可拮抗MAG對神經(jīng)細胞突起生長的抑制作用44-45
• 2.2 Bo NT/A HC和MAG相互作用對Neuro-2a細胞中抑制信號蛋白ROCK磷酸化的影響45-47
• 2.3 Bo NT/A HC和MAG相互作用對Neuro-2a細胞中再生信號蛋白ERK1/2、Akt/PKB的磷酸化的影響47-50
• 討論50-55
• 結論55-56
• 參考文獻56-59
• 綜述59-68
• 參考文獻66-68
• 致謝68-69
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果69-71
• 個人簡歷71

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本文編號：307429