本文關(guān)鍵詞：A型肉毒素重鏈拮抗髓磷脂相關(guān)糖蛋白抑制Neuro-2a神經(jīng)細(xì)胞突起生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1.體外實(shí)驗(yàn)觀察髓磷脂相關(guān)糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)對(duì)Neuro-2a細(xì)胞神經(jīng)突起生長(zhǎng)的抑制作用及對(duì)相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路Rho A/ROCK的影響。2.觀察A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素重鏈(botulinum neurotoxin serotype-A heavy chain,Bo NT/A HC)對(duì)Neuro-2a細(xì)胞的促神經(jīng)突起再生作用并探討相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制。3.探討B(tài)o NT/A HC是否能夠拮抗MAG對(duì)神經(jīng)突起生長(zhǎng)的抑制作用。方法:1.采用免疫熒光染色檢測(cè)Neuro-2a細(xì)胞MAG特異性受體NgR的表達(dá),確定外源性MAG可以干預(yù)Neuro-2a細(xì)胞的必備結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上,將外源性MAG加入培養(yǎng)液內(nèi),于不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞觀察MAG在Neuro-2a細(xì)胞中的分布特征以確定NgR的激活。然后在培養(yǎng)液中加入不同濃度的MAG,24 h、48 h、72 h后收集細(xì)胞經(jīng)bIII-tubulin免疫熒光染色后,在熒光倒置顯微鏡下觀察并攝取圖像。每個(gè)濃度組、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)定6個(gè)孔,在高倍鏡下(40X)每孔隨機(jī)攝取圖片4張,每組共計(jì)攝取圖片24張,在圖片上進(jìn)行細(xì)胞突起長(zhǎng)度及有突起細(xì)胞占圖片上所有細(xì)胞的百分比的測(cè)定。隨后,選擇最低有效濃度的MAG作為處理劑量加入細(xì)胞培養(yǎng)液,于不同時(shí)間點(diǎn)收集全細(xì)胞蛋白進(jìn)行Rho A活性的測(cè)定及ROCK磷酸化的檢測(cè)。2.細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的BoNT/A HC進(jìn)行干預(yù),按上述方法進(jìn)行分組設(shè)孔,于24 h、48 h、72 h后收集細(xì)胞進(jìn)行bIII-tubulin的免疫熒光染色并攝取圖像,對(duì)細(xì)胞突起長(zhǎng)度及有突起細(xì)胞占圖片上所有細(xì)胞的百分比進(jìn)行計(jì)算,確定重鏈的最佳促神經(jīng)突起生長(zhǎng)作用濃度;隨后,以最有效BoNT/A HC濃度作為處理劑量加入細(xì)胞培養(yǎng)液,同時(shí),于Bo NT/A HC作用后不同時(shí)間點(diǎn)收集全細(xì)胞蛋白采用SDS-PAGE/Western-blot檢測(cè)ERK1/2及Akt的磷酸化改變。3.基于上述,1noml/LBo NT/A HC和20nmol/LMAG為實(shí)驗(yàn)劑量,以三種不同方式將其加入細(xì)胞培養(yǎng)液:1)加入bont/ahc1h后再加入mag;2)加入mag后1h再加入bont/ahc;3)將mag與bont/ahc同時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)。分別于上述不同方式加入mag和bont/ahc后24h、48h、72h收集細(xì)胞進(jìn)行biii-tubulin免疫熒光染色以觀察細(xì)胞突起生長(zhǎng)的變化。于此同時(shí),選擇同樣的處理方式作用于細(xì)胞10min、15min、1h、2h收集全細(xì)胞蛋白,采用sds-page及western-blot檢測(cè)rock、erk1/2及akt的磷酸化。結(jié)果:1.免疫熒光顯示:1)neuro-2a細(xì)胞表達(dá)ngr;2)外源性給予mag后1h可見neuro-2a細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)mag的強(qiáng)陽性染色,提示外源性mag可以通過與ngr的結(jié)合內(nèi)吞入胞;3)培養(yǎng)液內(nèi)加入mag使neuro-2a細(xì)胞突起生長(zhǎng)抑制,表現(xiàn)為突起長(zhǎng)度顯著低于對(duì)照組(p0.05),有突起細(xì)胞占圖片上所有細(xì)胞的百分比也較對(duì)照組減少(p0.05);4)sds-page/western-blot結(jié)果顯示:培養(yǎng)液內(nèi)加入20nmol/lmag后5min、10min、20min,neuro-2a細(xì)胞內(nèi)rhoa活性均較對(duì)照組增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p0.05),于此同時(shí),rock的磷酸化也較對(duì)照組增強(qiáng)(p0.05)。2.單純向培養(yǎng)液內(nèi)加入不同濃度的bont/ahc時(shí)(0.1nmol/l、1nmol/l、10nmol/l),細(xì)胞突起的長(zhǎng)度及有突起細(xì)胞的百分比與對(duì)照組相比皆明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),其中1nmol/l效果最顯著;同時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入1nmol/l的bont/ahc,分別于15min、30min、60min、90min、2h、3h、4h、5h時(shí)檢測(cè)erk1/2的磷酸化,于15min、30min、60min、120min時(shí)檢測(cè)akt的磷酸化。當(dāng)bont/ahc作用60min后,erk1/2磷酸化水平較對(duì)照組開始增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);當(dāng)bont/ahc作用15min和60min時(shí),akt的磷酸化水平增加,與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3.當(dāng)以上述三種不同的方式將1nmol/l的bont/ahc和20nmol/l的mag加入neuro-2a細(xì)胞培養(yǎng)液后發(fā)現(xiàn):24h、48h、72h后細(xì)胞突起長(zhǎng)度及有突起細(xì)胞百分比與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p0.05);三種處理方式作用于細(xì)胞10min、15min后檢測(cè)rock及akt的磷酸化與對(duì)照組比較無顯著性差異(p0.05),作用1h、2h后檢測(cè)erk1/2的磷酸化也無顯著性差異(p0.05)。結(jié)論:1.Neuro-2a細(xì)胞表達(dá)NgR。外源性給予MAG可激活NgR介導(dǎo)的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制信號(hào)通路(Rho A-ROCK),抑制神經(jīng)突起生長(zhǎng)。2.小劑量Bo NT/A HC可以促進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞突起生長(zhǎng),并可促進(jìn)再生相關(guān)的信號(hào)蛋白ERK1/2和Akt的磷酸化。3.Bo NT/A HC可以拮抗MAG引起的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：A型肉毒素重鏈(BoNT/A HC) 髓磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG) Neuro-2a細(xì)胞株 神經(jīng)生長(zhǎng)抑制 神經(jīng)突起再生
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R338
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分 外源性髓磷脂相關(guān)糖蛋白抑制Neuro-2a細(xì)胞神經(jīng)突起生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)觀察14-31
• 1 材料與方法14-25
• 1.1 材料14-18
• 1.2 方法18-25
• 2 結(jié)果25-31
• 2.1 Neuro-2a細(xì)胞表達(dá)Nogo受體(Nogo Receptor,NgR)25
• 2.2 MAG的時(shí)間梯度熒光強(qiáng)度變化25-26
• 2.3 MAG對(duì)Neuro-2a細(xì)胞神經(jīng)突起生長(zhǎng)的影響26-28
• 2.4 外源性加入MAG增強(qiáng)Neuro-2a細(xì)胞Rho A活性28-29
• 2.5 外源性加入MAG促進(jìn)ROCK磷酸化29-31
• 第二部分 A型肉毒素重鏈對(duì)Neuro-2a細(xì)胞的促神經(jīng)突起再生作用31-41
• 1 材料與方法31-35
• 1.1 材料31-32
• 1.2 方法32-35
• 2 結(jié)果35-41
• 2.1 A型肉毒素重鏈對(duì)Neuro-2a細(xì)胞突起生長(zhǎng)的影響35-36
• 2.2 Bo NT/A HC刺激Neuo-2a細(xì)胞生成突起36-37
• 2.3 Bo NT/A HC促進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞中信號(hào)蛋白ERK1/2 的磷酸化37-39
• 2.4 Bo NT/A HC促進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞中信號(hào)蛋白Akt/PKB的磷酸化39-41
• 第三部分 BoNT/A HC拮抗MAG之神經(jīng)突起生長(zhǎng)抑制作用41-50
• 1 材料與方法41-44
• 1.1 材料41-42
• 1.2 方法42-44
• 2 結(jié)果44-50
• 2.1 Bo NT/A HC可拮抗MAG對(duì)神經(jīng)細(xì)胞突起生長(zhǎng)的抑制作用44-45
• 2.2 Bo NT/A HC和MAG相互作用對(duì)Neuro-2a細(xì)胞中抑制信號(hào)蛋白R(shí)OCK磷酸化的影響45-47
• 2.3 Bo NT/A HC和MAG相互作用對(duì)Neuro-2a細(xì)胞中再生信號(hào)蛋白ERK1/2、Akt/PKB的磷酸化的影響47-50
• 討論50-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 綜述59-68
• 參考文獻(xiàn)66-68
• 致謝68-69
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果69-71
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷71

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本文編號(hào)：307429