目的研究煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampt）基因在人胚胎干細(xì)胞生長中的作用。方法采用CRISPR/Cas9技術(shù)對人胚胎干細(xì)胞H9細(xì)胞系的Nampt基因進(jìn)行移碼突變;隨后,篩選Nampt基因突變細(xì)胞系進(jìn)行基因測序,同時(shí)在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)。另外,給予H9細(xì)胞不同濃度的Nampt抑制劑FK866進(jìn)行干預(yù),采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力。結(jié)果 Nampt基因發(fā)生突變后,人胚胎干細(xì)胞會逐漸死亡。同樣,Nampt抑制劑FK866也會抑制胚胎干細(xì)胞的活力,使細(xì)胞逐漸死亡。結(jié)論 Nampt基因?qū)S持人胚胎干細(xì)胞生長具有不可或缺的重要作用。 

【文章來源】：藥學(xué)實(shí)踐雜志. 2019,37(03)

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

圖１Ｎａｍｐｔ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９質(zhì)粒載體示意圖

胞電轉(zhuǎn)后降低嘌呤霉素篩選濃度（０．１μｇ／ｍｌ）篩選５ｄ。待細(xì)胞系擴(kuò)增后，挑取上述的單克隆提�。模危�，進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增后測序。結(jié)果顯示也無被編輯的細(xì)胞系。（３）為減少細(xì)胞死亡，在電轉(zhuǎn)后第１天添加ＲＯＣＫ抑制劑Ｙ２７６３２（１０μｍｏｌ／Ｌ）（僅第１天使用）［１１］，同時(shí)進(jìn)行０．３μｇ／ｍｌ嘌呤霉素抗性篩選，３ｄ后得到混合細(xì)胞系，提取ＤＮＡ后，進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增測序。測序結(jié)果顯示Ｎａｍｐｔ基因３個(gè)堿基被刪除，見圖２。７ｄ后再次對該混合細(xì)胞系提�。模危吝M(jìn)行ｓａｎｇｅｒ測序，結(jié)果顯示Ｎａｍｐｔ基因未被編輯。上述結(jié)果提示，Ｎａｍｐｔ基因突變是成功的，因?yàn)樵陔娹D(zhuǎn)后的較早期（第３天），細(xì)胞ＤＮＡ測序結(jié)果顯示Ｎａｍｐｔ基因的３個(gè)堿基被刪除。但是電轉(zhuǎn)后期（第５天、第７天）檢測不到Ｎａｍｐｔ基因突變的細(xì)胞，說明該基因突變細(xì)胞已死亡。圖２基因測序結(jié)果注：框內(nèi)為刪除的３個(gè)堿基３．３Ｎａｍｐｔ抑制劑ＦＫ８６６給藥結(jié)果如圖３所示，０．３、１、３和１０ｎｍｏｌ／Ｌ的Ｎａｍｐｔ抑制劑ＦＫ８６６對胚胎干細(xì)胞的生長抑制率分別為（２．９５±０．０１）％、（１３．７５±０．０１）％、（９０．０５±０．０１）％和（９５．６１±０．０２）％，各劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且ＦＫ８６６抑制人胚胎干細(xì)胞的生長呈劑量依賴性。從３ｎｍｏｌ／Ｌ劑量開始，ＦＫ８６６幾乎完全抑制胚胎干細(xì)胞生長。圖３ＦＫ８６６對胚胎干細(xì)胞生長的影響＊＊Ｐ＜０．０５，與對照組比較４討論Ｎａｍ

ｐｔ基因３個(gè)堿基被刪除，見圖２。７ｄ后再次對該混合細(xì)胞系提�。模危吝M(jìn)行ｓａｎｇｅｒ測序，結(jié)果顯示Ｎａｍｐｔ基因未被編輯。上述結(jié)果提示，Ｎａｍｐｔ基因突變是成功的，因?yàn)樵陔娹D(zhuǎn)后的較早期（第３天），細(xì)胞ＤＮＡ測序結(jié)果顯示Ｎａｍｐｔ基因的３個(gè)堿基被刪除。但是電轉(zhuǎn)后期（第５天、第７天）檢測不到Ｎａｍｐｔ基因突變的細(xì)胞，說明該基因突變細(xì)胞已死亡。圖２基因測序結(jié)果注：框內(nèi)為刪除的３個(gè)堿基３．３Ｎａｍｐｔ抑制劑ＦＫ８６６給藥結(jié)果如圖３所示，０．３、１、３和１０ｎｍｏｌ／Ｌ的Ｎａｍｐｔ抑制劑ＦＫ８６６對胚胎干細(xì)胞的生長抑制率分別為（２．９５±０．０１）％、（１３．７５±０．０１）％、（９０．０５±０．０１）％和（９５．６１±０．０２）％，各劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且ＦＫ８６６抑制人胚胎干細(xì)胞的生長呈劑量依賴性。從３ｎｍｏｌ／Ｌ劑量開始，ＦＫ８６６幾乎完全抑制胚胎干細(xì)胞生長。圖３ＦＫ８６６對胚胎干細(xì)胞生長的影響＊＊Ｐ＜０．０５，與對照組比較４討論Ｎａｍｐｔ是哺乳動(dòng)物體內(nèi)ＮＡＤ生物合成的重要限速酶，在生物體內(nèi)具有多種生理功能［６，１２］。另外，Ｎａｍｐｔ基因全身敲除的小鼠無法存活也說明了Ｎａｍｐｔ在生物體內(nèi)的重要性［１３］。本課題組在Ｎａｍｐｔ相關(guān)研究上做了大量工作，尤其是發(fā)現(xiàn)其在缺血性腦卒中的亞急性期和慢性期可以通過促進(jìn)血管新生和神經(jīng)再生從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)［１４－１５］。這些結(jié)果都提示Ｎａｍｐｔ在細(xì)胞的增殖分化上具有重要作用，但是目前Ｎａｍｐｔ在胚胎干


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