發(fā)布時間：2021-03-02 11:16

　　目的：構(gòu)建弓形蟲致密顆�？乖�-1（GRA1）真核表達(dá)質(zhì)粒，并觀察重組質(zhì)粒DNA接種誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。 方法：1、用免疫兔血清和2個單克隆抗體篩選弓形蟲速殖子cDNA文庫，對陽性克隆進(jìn)行序列分析；2、采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增出編碼GRA1目的基因，用EcoRⅠ／XhoⅠ分別對擴(kuò)增產(chǎn)物和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3進(jìn)行雙酶切，將GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位點；對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增、雙酶切初步鑒定后作序列測定；3、大量制備并提取重組質(zhì)粒pcDNA3／GRA1，肌肉注射法免疫小鼠；用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測特異性抗體水平及PCR檢測不同組織DNA中GRA1基因；用免疫熒光法（IFA）檢測GRA1蛋白在肌肉組織中的表達(dá)；用弓形蟲RH株速殖子攻擊感染免疫鼠，并觀察其存活時間。 結(jié)果：1、通過篩選弓形蟲cDNA文庫，共獲得12個陽性克隆。經(jīng)序列測定發(fā)現(xiàn)插入片段的大小在450bp-2400bp之間，查詢所有基因庫并經(jīng)EPAS（Expert Protein Analysis System）軟件分析鑒定出 3個新的基因，分別命名為Toxo-W5，T... 

【文章來源】：中南大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：40 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

弓形蟲速殖子cDNA文庫免疫篩選結(jié)果.陽性克隆的第三次篩選

論文弓形蟲真核表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3/GRAI的構(gòu)建及序列測定條與GRAI基因ORF片段大小一致的條帶，約為573bp;將重組子用反解I和肋口I雙酶切后出現(xiàn)兩條帶，即5.4Kb、0.57Kb(圖2一2);測序結(jié)果表明，該重組子含有GRAIORF基因片段(圖2一3)。圖2一1.PCR擴(kuò)增的GRAIO盯圖2一2.重組子雙酶切結(jié)果Fig.2一1AgarosegeleleetroPhoresisOfGRAIeneodinggeneobtainedbyPCRl:GRA12:Marker(kb)Fig.2一2RecombinantPcDNA3/GRA1digestedbyEeoRI/Xholl:PeDNA3/GRA12:Marker(kb)TAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCCATGGTGCGTGTGAGCGCTATTGTCGGAGCTGCTGCATCGGTGTTCGTGTGCCTGTCTGCCGGCGCTTACGCTGCCGAAGGCGGCGACAACCAGTCGAGCGCCGTCTCAAATCGGGCGTCTCTCTTTGGTTTGCTGAGTGGAGGGACAGGGCAGGGATTAGG^^丁eeGAG^^丁e丁G丁^彝A丁蘸丁G。^e^下GA丁。eGoAAeAee丁A丁e。下G丁GG^GAG^eeeAeAGGCAACCCGGACTTGCTCAAGATCGCCATTAAAGCTTCAGATGGATCGTACAGCGAAGTCGGCAATGTTAACGTGGAGGAGGTGATTGATACTATGAAAAGCATGCAGAGGGACGAGGACATTTTCCTTCGTGCGTTGAACAAAGGCGAAACAGTAGAGGAAGCGATCGAAGACGTGGCTCAAGCAGAAGGGTTTAATTCGGAGCAAACCCTGCAACTGGAAAATGCAGTGAGCGCGGTGGCGTCTGTTGTTCAAGACGAGATGAAGGTGATCGACGATGTGCAGCAGCTTGAAAAGGACAAACAACAGCTTAAGGATGACATTGGGTTCCTAACAGGAGAGAGAGAGTAATTGGAGGTAGCTTTGTTGTGATCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCC圖2一3.重組子GRAIORF序歹，!Fig.2一3SequeneeofreeombinantGRAIO盯(下劃線部分為引物位置Underlinedpartindieatingprimers

弓形蟲PcDNA3/GRAI重組質(zhì)粒免疫小鼠的保護(hù)性效果觀察圖3一1不同免疫組小鼠的組織DNAPCR產(chǎn)物凝膠電泳分析M:Marker(bp)1:pcDNA3/GRAI雙酶切結(jié)果2:pcDNA3/GR^1免疫小鼠的肌肉3:poDNA3免疫小鼠的肌肉4:生理鹽水對照組小鼠的肌肉5:peDNA3/GRAI免疫小鼠的血細(xì)胞6:pcDNA3免疫小鼠的血細(xì)胞7:生理鹽水對照組小鼠的血細(xì)胞Fig.3一1Agarosegel一eleetroPhoresisoftissueDNAPCRProduetsofvariousimmunitedgrouPsM:Markerl:PeDNA3/GRAIdigestedbyEeoRI/Xho1.2:MuseleofmieeimmunizedwithPeDNA3/GRAI.3:MuseleofmieeimmunizedwithPeDNA3.4:MuseleofmieeimmunizedwithNS.5:BloodeellsofmieeimmunizedwithPcDNA3/GRAI.6:BloodeellsofmieeimmunizedwithPcDNA3.7:BloodeellsofmieeimmunizedwithNS.歡，撬，!一襄鸚一，纓圖3一2pcDNA3/GRAI免疫小鼠的不同組織DNAPCR產(chǎn)物檢測1:肝臟2:心臟3:脾臟4:肺臟5:血液6:腎臟7:肌肉Fig.3一2PCRProduetsfromdifferenttissuesofmiceimmunizedWithPeDNA3/GRAI.l:liverZ:heart3:sPleen4:lungs:blood6:kidney7:musele3.2.3免疫熒光法檢測GRAI基因在小鼠肌細(xì)胞的表達(dá)用弓形蟲免疫兔血清同時檢測三組小鼠肌肉組織切片中GRAI表達(dá)情況，在pcDNA3/GRAI免疫組肌細(xì)胞上可見呈點狀或片狀分布的熒光反應(yīng)(圖3一3)，而pcDNA3和NS免疫組無陽性反應(yīng)(圖3一4)。表明GRAI在pcDNA3/GRAI免疫組小鼠的肌細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)。3.2.4抗攻擊感染的免疫保護(hù)作用于免疫后的第5周經(jīng)腹腔注射約500

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3059170