本文關(guān)鍵詞：microRNA-21參與鍶促細(xì)胞成骨分化及外泌體提取方法改良，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:鍶(Sr)是人體內(nèi)一種重要的微量元素,在元素周期表中與鈣同族,具有相似的化學(xué)性質(zhì)。作為骨的重要成分,由于具有促進(jìn)骨生成和抑制骨吸收的雙重作用,鍶及相關(guān)生物材料在骨質(zhì)疏松治療及骨缺損填充中的應(yīng)用受到高度關(guān)注,比如雷奈酸鍶廣泛的應(yīng)用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松。到目前為止,關(guān)于鍶作用機制的探討已經(jīng)深入到分子層次,包括:鍶與細(xì)胞膜上的鈣受體或其它受體結(jié)合,激活細(xì)胞內(nèi)信號通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和成熟行為,進(jìn)而促進(jìn)骨基質(zhì)的合成等,但鍶具體作用機制,仍需要進(jìn)一步完善。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA是調(diào)控成骨分化的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,對成骨細(xì)胞的分化發(fā)育具有重要調(diào)控作用,包括正性和負(fù)性雙重調(diào)節(jié)作用,但miRNA這一重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子是否也在鍶促進(jìn)成骨分化機制中發(fā)揮作用尚不明確。本課題就鍶促進(jìn)細(xì)胞成骨分化過程中miRNA-21表達(dá)變化以及其在鍶促進(jìn)成骨分化過程中的作用加以探討。外泌體(exosome)是具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的膜源性小囊泡,直徑多介于30-100 nm,可以由多種細(xì)胞合成。外泌體內(nèi)含有不同種類的micro RNAs、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、m RNAs、t RNAs、信號分子等生物學(xué)活性物質(zhì),易與鄰近細(xì)胞膜發(fā)生融合,將生物學(xué)活性物質(zhì)選擇性地遞呈至受體細(xì)胞,從而完成信息傳遞,調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信號傳導(dǎo),發(fā)揮生物學(xué)功能。鍶促進(jìn)成骨分化過程中,外泌體是否也發(fā)揮重要調(diào)控機制尚不清楚,而獲得高純度、無丟失的外泌體樣本是進(jìn)一步探尋該機制的研究基礎(chǔ)。因此本課題同時就外泌體提取方法的改良比較進(jìn)行探討,為外泌體深入研究奠定基礎(chǔ)。方法:一、采用不同濃度(0,1,3,6,9,12 mM)的氯化鍶(SrCl_2)溶液對小鼠前成肌細(xì)胞C2C12進(jìn)行成骨誘導(dǎo)72h,MTT法檢測不同濃度鍶對細(xì)胞增殖的影響作用,確定適宜的鍶誘導(dǎo)濃度;實驗組以1mM和3mM鍶誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞,對照組培養(yǎng)條件與實驗組相同,但不加鍶誘導(dǎo),72h后分別提取細(xì)胞總蛋白和總RNA,以蛋白免疫印跡(Western blotting,WB)檢測成骨標(biāo)志phospho1蛋白表達(dá)水平變化,以實時熒光定量PCR法檢測phospho1以及micro RNA-21基因表達(dá)情況;同時,實驗組和對照組細(xì)胞均培養(yǎng)7d后,進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)染色;對C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor,6h后加入3mM鍶誘導(dǎo)72h,檢測phospho1基因以及蛋白表達(dá)情況;以PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002對細(xì)胞預(yù)處理2h,隨后加入3mM鍶誘導(dǎo)72h,檢測phospho1基因及蛋白表達(dá)水平改變。二、分別用ExoQuick試劑盒及改良方法、超速離心法提取血清外泌體。利用透射電鏡對外泌體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;樣本進(jìn)行2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)法蛋白定量;Western blotting檢測外泌體表面標(biāo)志物CD63;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析樣本蛋白表達(dá)差異。結(jié)果:一、MTT結(jié)果顯示,低濃度鍶(1,3mM)誘導(dǎo)細(xì)胞后,其增殖情況與對照組相比無明顯差異(p0.05),而較高濃度的鍶(6,9,12mM)對細(xì)胞增殖具有一定的損害作用(p0.05),因此本課題采用低濃度鍶誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞成骨分化;分別以1mM和3mM鍶對C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)72h后,phospho1基因和蛋白表達(dá)均升高(p0.05),且3mM鍶對C2C12細(xì)胞的誘導(dǎo)成骨分化作用較1mM鍶明顯;同時檢測小RNA miR-21發(fā)現(xiàn),其表達(dá)也較對照組明顯上調(diào)(p0.05);對C2C12細(xì)胞進(jìn)行miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染后,鍶促進(jìn)成骨作用消失,phospho1基因以及蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(p0.05);以PI3K/AKT通路抑制劑LY294002對細(xì)胞預(yù)處理后,同樣抑制了鍶對C2C12的誘導(dǎo)成骨作用,phospho1基因和蛋白表達(dá)水平下降。二、ExoQuick試劑盒及改良方法、超速離心法均可獲得血清exosome,電鏡下可觀察到圓形或橢圓形膜性囊泡結(jié)構(gòu);傳統(tǒng)超速離心法提取樣本蛋白濃度顯著低于ExoQuick試劑盒法及其改進(jìn)方法(P0.05);SDS-PAGE顯示三種方法提取樣本蛋白表達(dá)強度及豐度存在差異;western blotting表明三種方法提取的外泌體均表達(dá)表面特異性標(biāo)志物CD63,且含同濃度蛋白的情況下,ExoQuick Precipitation及改良法其CD63含量明顯高于傳統(tǒng)超速離心法。結(jié)論:一、低濃度的鍶對細(xì)胞無明顯毒性且具有明顯的促成骨作用。結(jié)果表明,鍶可通過上調(diào)miR-21促進(jìn)PI3K/AKT通路活化以促進(jìn)促成骨因子phsopho1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞成骨。二、ExoQuick試劑盒及改良方法、超速離心法均能提取血清中外泌體,ExoQuick試劑盒法及改良方法具有更高的提取外泌體效率,同時改進(jìn)方法能夠有效的去除提取樣品中的雜蛋白。
【關(guān)鍵詞】：鍶 成骨分化 miR-21 phospho1 外泌體
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R336
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-18
• 研究現(xiàn)狀、成果11-17
• 研究目的、方法17-18
• 一、鍶促進(jìn)成骨分化機制研究18-35
• 1.1 對象和方法19-28
• 1.1.1 研究對象19
• 1.1.2 試劑與儀器19-20
• 1.1.3 研究方法20-28
• 1.1.4 統(tǒng)計學(xué)處理28
• 1.2 結(jié)果28-31
• 1.2.1 不同濃度鍶對C2C12細(xì)胞增殖的影響28
• 1.2.2 鍶對C2C12細(xì)胞成骨分化的影響28-29
• 1.2.3 鍶促進(jìn)C2C12成骨分化對miR-21的影響29-30
• 1.2.4 鍶促進(jìn)C2C12成骨分化中miR-21的作用30-31
• 1.2.5 鍶促進(jìn)C2C12成骨分化中PI3K/AKT通路的作用31
• 1.3 討論31-34
• 1.4 小結(jié)34-35
• 二、ExoQuick提取人血清外泌體方法改良及比較35-44
• 2.1 對象和方法35-39
• 2.1.1 研究對象35-36
• 2.1.2 試劑與儀器36
• 2.1.3 研究方法36-39
• 2.1.4 統(tǒng)計學(xué)處理39
• 2.2 結(jié)果39-42
• 2.2.1 外泌體形態(tài)觀察39-40
• 2.2.2 不同外泌體樣本蛋白濃度定量40
• 2.2.3 SDS-PAGE電泳及凝膠圖像分析40-41
• 2.2.4 外泌體表面標(biāo)志CD63分析41
• 2.2.5 三種方法操作時間比較41-42
• 2.3 討論42-43
• 2.4 小結(jié)43-44
• 結(jié)論44-46
• 參考文獻(xiàn)46-57
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明57-58
• 綜述 microRNA與成骨分化的研究進(jìn)展58-68
• 綜述參考文獻(xiàn)63-68
• 致謝68-69
• 個人簡歷69

  本文關(guān)鍵詞：microRNA-21參與鍶促細(xì)胞成骨分化及外泌體提取方法改良，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：304702