本文關鍵詞：microRNA-21參與鍶促細胞成骨分化及外泌體提取方法改良，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:鍶(Sr)是人體內一種重要的微量元素,在元素周期表中與鈣同族,具有相似的化學性質。作為骨的重要成分,由于具有促進骨生成和抑制骨吸收的雙重作用,鍶及相關生物材料在骨質疏松治療及骨缺損填充中的應用受到高度關注,比如雷奈酸鍶廣泛的應用于預防和治療骨質疏松。到目前為止,關于鍶作用機制的探討已經深入到分子層次,包括:鍶與細胞膜上的鈣受體或其它受體結合,激活細胞內信號通路,調節(jié)細胞分化和成熟行為,進而促進骨基質的合成等,但鍶具體作用機制,仍需要進一步完善。近年來研究發(fā)現miRNA是調控成骨分化的重要轉錄后調節(jié)因子,對成骨細胞的分化發(fā)育具有重要調控作用,包括正性和負性雙重調節(jié)作用,但miRNA這一重要轉錄后調節(jié)因子是否也在鍶促進成骨分化機制中發(fā)揮作用尚不明確。本課題就鍶促進細胞成骨分化過程中miRNA-21表達變化以及其在鍶促進成骨分化過程中的作用加以探討。外泌體(exosome)是具有脂質雙層結構的膜源性小囊泡,直徑多介于30-100 nm,可以由多種細胞合成。外泌體內含有不同種類的micro RNAs、蛋白質、脂質、m RNAs、t RNAs、信號分子等生物學活性物質,易與鄰近細胞膜發(fā)生融合,將生物學活性物質選擇性地遞呈至受體細胞,從而完成信息傳遞,調節(jié)細胞間的信號傳導,發(fā)揮生物學功能。鍶促進成骨分化過程中,外泌體是否也發(fā)揮重要調控機制尚不清楚,而獲得高純度、無丟失的外泌體樣本是進一步探尋該機制的研究基礎。因此本課題同時就外泌體提取方法的改良比較進行探討,為外泌體深入研究奠定基礎。方法:一、采用不同濃度(0,1,3,6,9,12 mM)的氯化鍶(SrCl_2)溶液對小鼠前成肌細胞C2C12進行成骨誘導72h,MTT法檢測不同濃度鍶對細胞增殖的影響作用,確定適宜的鍶誘導濃度;實驗組以1mM和3mM鍶誘導C2C12細胞,對照組培養(yǎng)條件與實驗組相同,但不加鍶誘導,72h后分別提取細胞總蛋白和總RNA,以蛋白免疫印跡(Western blotting,WB)檢測成骨標志phospho1蛋白表達水平變化,以實時熒光定量PCR法檢測phospho1以及micro RNA-21基因表達情況;同時,實驗組和對照組細胞均培養(yǎng)7d后,進行堿性磷酸酶(ALP)染色;對C2C12細胞轉染miR-21 inhibitor,6h后加入3mM鍶誘導72h,檢測phospho1基因以及蛋白表達情況;以PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002對細胞預處理2h,隨后加入3mM鍶誘導72h,檢測phospho1基因及蛋白表達水平改變。二、分別用ExoQuick試劑盒及改良方法、超速離心法提取血清外泌體。利用透射電鏡對外泌體進行形態(tài)學觀察;樣本進行2,2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)法蛋白定量;Western blotting檢測外泌體表面標志物CD63;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析樣本蛋白表達差異。結果:一、MTT結果顯示,低濃度鍶(1,3mM)誘導細胞后,其增殖情況與對照組相比無明顯差異(p0.05),而較高濃度的鍶(6,9,12mM)對細胞增殖具有一定的損害作用(p0.05),因此本課題采用低濃度鍶誘導C2C12細胞成骨分化;分別以1mM和3mM鍶對C2C12細胞誘導72h后,phospho1基因和蛋白表達均升高(p0.05),且3mM鍶對C2C12細胞的誘導成骨分化作用較1mM鍶明顯;同時檢測小RNA miR-21發(fā)現,其表達也較對照組明顯上調(p0.05);對C2C12細胞進行miR-21 inhibitor轉染后,鍶促進成骨作用消失,phospho1基因以及蛋白表達明顯下調(p0.05);以PI3K/AKT通路抑制劑LY294002對細胞預處理后,同樣抑制了鍶對C2C12的誘導成骨作用,phospho1基因和蛋白表達水平下降。二、ExoQuick試劑盒及改良方法、超速離心法均可獲得血清exosome,電鏡下可觀察到圓形或橢圓形膜性囊泡結構;傳統(tǒng)超速離心法提取樣本蛋白濃度顯著低于ExoQuick試劑盒法及其改進方法(P0.05);SDS-PAGE顯示三種方法提取樣本蛋白表達強度及豐度存在差異;western blotting表明三種方法提取的外泌體均表達表面特異性標志物CD63,且含同濃度蛋白的情況下,ExoQuick Precipitation及改良法其CD63含量明顯高于傳統(tǒng)超速離心法。結論:一、低濃度的鍶對細胞無明顯毒性且具有明顯的促成骨作用。結果表明,鍶可通過上調miR-21促進PI3K/AKT通路活化以促進促成骨因子phsopho1的表達促進細胞成骨。二、ExoQuick試劑盒及改良方法、超速離心法均能提取血清中外泌體,ExoQuick試劑盒法及改良方法具有更高的提取外泌體效率,同時改進方法能夠有效的去除提取樣品中的雜蛋白。
【關鍵詞】：鍶 成骨分化 miR-21 phospho1 外泌體
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R336
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-18
• 研究現狀、成果11-17
• 研究目的、方法17-18
• 一、鍶促進成骨分化機制研究18-35
• 1.1 對象和方法19-28
• 1.1.1 研究對象19
• 1.1.2 試劑與儀器19-20
• 1.1.3 研究方法20-28
• 1.1.4 統(tǒng)計學處理28
• 1.2 結果28-31
• 1.2.1 不同濃度鍶對C2C12細胞增殖的影響28
• 1.2.2 鍶對C2C12細胞成骨分化的影響28-29
• 1.2.3 鍶促進C2C12成骨分化對miR-21的影響29-30
• 1.2.4 鍶促進C2C12成骨分化中miR-21的作用30-31
• 1.2.5 鍶促進C2C12成骨分化中PI3K/AKT通路的作用31
• 1.3 討論31-34
• 1.4 小結34-35
• 二、ExoQuick提取人血清外泌體方法改良及比較35-44
• 2.1 對象和方法35-39
• 2.1.1 研究對象35-36
• 2.1.2 試劑與儀器36
• 2.1.3 研究方法36-39
• 2.1.4 統(tǒng)計學處理39
• 2.2 結果39-42
• 2.2.1 外泌體形態(tài)觀察39-40
• 2.2.2 不同外泌體樣本蛋白濃度定量40
• 2.2.3 SDS-PAGE電泳及凝膠圖像分析40-41
• 2.2.4 外泌體表面標志CD63分析41
• 2.2.5 三種方法操作時間比較41-42
• 2.3 討論42-43
• 2.4 小結43-44
• 結論44-46
• 參考文獻46-57
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明57-58
• 綜述 microRNA與成骨分化的研究進展58-68
• 綜述參考文獻63-68
• 致謝68-69
• 個人簡歷69

  本文關鍵詞：microRNA-21參與鍶促細胞成骨分化及外泌體提取方法改良，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：304702