本文關鍵詞：與CVB3 3A相互作用的人心臟蛋白的篩選及功能初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:運用酵母雙雜交技術,從人心臟c DNA文庫中篩選與CVB3非結構蛋白3A相互作用的人細胞蛋白;選取陽性蛋白之一的TMED4進行研究,探討CVB3 3A與TMED4的相互作用及其生物學意義,為進一步研究CVB3的致病機制及治療CVB3引起的相關疾病提供新的方向和依據。方法:1.以病毒RNA為模板,逆轉錄合成c DNA,再經PCR擴增出3A基因,并將其重組至真核表達質粒p GBKT7中,構建誘餌質粒p GBKT7-3A;2.采用乙酸鋰法將誘餌質粒p GBKT7-3A轉化至酵母菌AH109中;3.Western Blot檢測融合蛋白DNA-BD-c-Myc-3A在酵母菌AH109[p GBKT7-3A]中的表達;4.SD/ Ade/ Trp和SD/ His/ Trp營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基及X-α-Gal實驗檢測3A對報告基因(HIS3、ADE2和MEL1)的轉錄自激活作用,小規(guī)模配合實驗檢測酵母菌的配合功能;5.大規(guī)模配合篩選與3A蛋白相互作用的人細胞蛋白;6.采用表型鑒定、PCR擴增和Alu I酶切等實驗方法對篩選所得陽性候選克隆進行歸類、測序及同源性比對分析;7.SD/ Ade/ Leu和SD/ His/ Leu營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基的鑒定方法及X-α-Gal實驗檢測篩選所得陽性質粒p GADT7-ADx對報告基因(HIS3、ADE2和MEL1)的轉錄自激活作用,利用回返配合實驗初步驗證3A蛋白與各陽性蛋白的相互作用;8.質粒p Bud CE4.1-3A轉染He La細胞36 h后,采用免疫熒光雙標技術,用Alexa Flour 488山羊抗兔二抗(綠色熒光)與兔抗TMED4的特異性結合來標記TMED4在細胞內的定位,用Rhodamine山羊抗鼠二抗(紅色熒光)與鼠抗His-Tag的特異性結合來標記3A在細胞中的定位,利用高內涵細胞成像分析系統(tǒng)觀察3A蛋白與TMED4在細胞內的共定位情況,同時設立正常細胞作為陰性對照;9.質粒p Bud CE4.1-3A轉染He La細胞48 h后,收集細胞蛋白裂解液,分別采用anti-TMED4或anti-His-Tag進行細胞內免疫共沉淀,進一步驗證3A蛋白與陽性蛋白TMED4之間的相互作用;10.收集質粒p Bud CE4.1-3A和p Bud CE4.1轉染后24 h、36 h、48 h各時間點細胞,加入CCK-8溶液后酶標儀檢測波長490 nm處各樣品OD值,采用SPSS 13.0軟件對結果進行分析;11.收集質粒p Bud CE4.1-3A和p Bud CE4.1轉染后24 h、36 h、48 h各時間點細胞,使用Annexin V試劑盒對早期凋亡細胞進行染色后,高內涵細胞成像分析系統(tǒng)對早期凋亡細胞進行計數分析;12.質粒p Bud CE4.1-3A對細胞周期的影響:以G1/S期為切入點,收集質粒p Bud CE4.1-3A和p Bud CE4.1轉染后24 h、36 h、48 h、54 h各時間點的細胞,應用流式細胞儀檢測細胞周期的變化;13.用質粒p Bud CE4.1-3A轉染He La細胞18 h、24 h、36 h、40 h、48 h、54 h、60 h,采用MOI=5的CVB3感染He La細胞3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h,收集各時間點細胞蛋白裂解液,同時設立正常細胞和空質粒轉染組細胞為對照,Western Blot檢測細胞內TMED4的表達情況。結果:1.雙酶切鑒定及測序結果提示3A已成功重組至p GBKT7載體的多克隆位點,且閱讀框與病毒3A基因一致;2.表型鑒定和PCR法驗證重組誘餌質粒p GBKT7-3A已成功轉入酵母菌AH109中;3.3A能在酵母菌AH109[p GBKT7-3A]中表達并且對酵母菌無毒性作用;4.SD/ Ade/ Trp和SD/ His/ Trp營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基和酶底物X-α-Gal顏色的變化情況顯示3A對報告基因無轉錄自激活作用,小規(guī)模配合實驗表明3A蛋白在AH109中的表達不影響酵母菌的配合功能;5.以CVB3 3A為誘餌,經大規(guī)模配合實驗,從人心臟c DNA文庫中篩選得到52個陽性候選克隆;6.五十二個陽性候選克隆經Alu I酶切分析后可歸為6類,通過測序和同源性比對,共獲得6種不同類別的陽性蛋白:蘭尼堿受體2(Ryanodine Receptor2,Ry R2),信號肽酶2(Signal peptidase complex subunit 2,SPCS2),跨膜蛋白emp24(Transmembrane emp24 protein transport domain containing 4,TMED4),細胞色素c氧化酶亞基I(Cytochrome c oxidase subunit I,COX1),細胞色素c氧化酶亞基III(Cytochrome c oxidase subunit III,COX3)和肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain,MYH7)/琥珀酸脫氫酶亞基D(Succinate dehydrogenase complex subunit D,SDHD);7.SD/ Ade/ Leu和SD/ His/ Leu營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基和酶底物X-α-Gal顏色的變化情況顯示6種陽性蛋白對報告基因無轉錄自激活作用,回返配合實驗初步驗證6種陽性蛋白與3A蛋白存在相互作用;8.高內涵細胞成像分析系統(tǒng)顯示宿主蛋白TMED4主要在胞漿中表達,而病毒蛋白3A主要表達在胞漿核周區(qū)域,提示3A與TMED4在細胞胞漿內存在共定位現(xiàn)象;9.在質粒p Bud CE4.1-3A轉染后的細胞中,3A蛋白能夠被anti-TMED4抗體共沉淀,而TMED4也能夠被anti-His-tag抗體共沉淀。細胞內免疫共沉淀結果提示:在質粒p Bud CE4.1-3A轉染后的細胞內,3A與TMED4能夠發(fā)生相互作用;10.CCK-8法結果提示:質粒p Bud CE4.1-3A轉染細胞后36 h時間點細胞活性與空質粒轉染組相比明顯下降,且差異具有統(tǒng)計學意義,而轉染24 h和48 h時間點的細胞活性與空質粒轉染組相比無明顯差異;11.高內涵細胞成像分析系統(tǒng)觀察早期凋亡細胞:質粒轉染后36 h,3A轉染組凋亡細胞數較空質粒轉染組有明顯增高,且差異具有統(tǒng)計學意義,而轉染24 h和48 h時間點兩組細胞并無明顯差異;12.流式細胞儀檢測結果顯示:轉染3A的細胞組G1期細胞比例一直高于轉染空質粒的對照組,54 h細胞組G1期細胞比例差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),而S期、G2期的細胞比例沒有明顯變化。13.收集質粒轉染和活病毒感染各時間點細胞蛋白裂解液,Western Blot檢測結果:3A轉染細胞后,細胞內的TMED4表達量逐漸下降,于轉染36 h時間點達到最低,隨后開始回升,至60 h后維持穩(wěn)定;空質粒轉染對照組細胞內TMED4表達量未發(fā)現(xiàn)明顯改變;CVB3活病毒感染細胞后細胞內TMED4的表達逐漸下降,于感染9 h時間點達到最低,隨后開始回升,正常細胞對照組TMED4表達量無明顯改變。質粒轉染實驗和活病毒感染實驗兩項結果存在一致性。結論:1.以CVB3 3A為誘餌,應用酵母雙雜交技術,成功從人心臟c DNA文庫中篩選獲得6種與3A相互作用的人心臟蛋白:Ry R2、SPCS2、TMED4、COX1、COX3和MYH7/SDHD;2.3A與陽性蛋白TMED4在細胞內可能存在相互作用;3.3A在細胞中的表達影響細胞的活性,并通過下調TMED4的表達量來參與細胞凋亡;
【關鍵詞】：CVB3 非結構蛋白3A 酵母雙雜交系統(tǒng) 蛋白相互作用
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R373.2
【目錄】：

• 摘要3-7
• Abstract7-14
• 第1章 引言14-18
• 1.1 柯薩奇病毒B組3型（Coxsackievirus group B type 3,CVB3）14-15
• 1.2 3A蛋白15-16
• 1.3 酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system）16-17
• 1.4 本論文研究基礎和研究意義17-18
• 第2章 材料與方法18-33
• 2.1 實驗材料18-22
• 2.1.1 菌株18
• 2.1.2 質粒18
• 2.1.3 主要試劑18-19
• 2.1.4 主要設備19-20
• 2.1.5 各類培養(yǎng)基20-21
• 2.1.6 Western-Blot所用試劑21-22
• 2.2 實驗方法22-33
• 2.2.1 p GBKT7-3A重組質粒的構建（圖 2.1）22-24
• 2.2.2 重組質粒p GBKT7-3A在酵母菌AH109中的表達24-26
• 2.2.3 3A對報告基因的轉錄自激活檢測26
• 2.2.4 檢測 3A的表達對酵母菌配合的影響26-27
• 2.2.5 篩選與 3A相互作用的蛋白27-28
• 2.2.6 陽性候選克隆的初步分析28-29
• 2.2.7 質粒DNA瞬時轉染29
• 2.2.8 免疫熒光雙標29-30
• 2.2.9 細胞內免疫共沉淀30-31
• 2.2.10 CCK-8 檢測 3A對Hela細胞的活性影響31
• 2.2.11 Annexin V檢測 3A對細胞凋亡的影響31
• 2.2.12 流式細胞儀檢測 3A對細胞周期的影響31
• 2.2.13 病毒感染Hela細胞31-33
• 第3章 結果33-46
• 3.1 CVB33A是一個適合用于酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌蛋白33-36
• 3.1.1 重組質粒p GBKT7-3A的酶切鑒定33
• 3.1.2 重組質粒p GBKT7-3A的基因測序33-34
• 3.1.3 酵母菌AH109[p GBKT7-3A]的表型驗證34
• 3.1.4 融合蛋白DNA-BD-c-Myc-3A表達的檢測34
• 3.1.5 3A對報告基因無轉錄自激活作用34-35
• 3.1.6 3A對酵母配合功能的影響35-36
• 3.2 經大規(guī)模配合實驗篩選得到6個相互作用的人心臟蛋白36-39
• 3.2.1 人心臟c DNA文庫滴定36
• 3.2.2 大規(guī)模酵母配合實驗的配合效率36
• 3.2.3 陽性候選克隆的初步分析36-39
• 3.3 3A與TMED4相互作用的進一步驗證39-40
• 3.3.1 高內涵細胞成像分析系統(tǒng)觀察 3A與TMED4存在細胞共定位39
• 3.3.2 細胞內免疫共沉淀檢測 3A與TMED4的相互作用39-40
• 3.4 3A與TMED4的相互作用對細胞的影響40-46
• 3.4.1 CCK-8 檢測 3A對He La細胞的活性影響40-41
• 3.4.2 Annexin V檢測 3A對細胞凋亡的影響41
• 3.4.3 流式細胞儀檢測 3A對細胞周期的影響41-43
• 3.4.4 3A對細胞中TMED4表達量的影響43-46
• 第4章 討論46-53
• 4.1 與 3A相互作用的6個人細胞蛋白46-47
• 4.2 TMED447-48
• 4.3 CVB33A與TMED4相互作用的進一步確證48-49
• 4.4 細胞凋亡49-50
• 4.5 3A與細胞凋亡的關系50-53
• 第5章 結論與展望53-54
• 5.1 結論53
• 5.2 展望53-54
• 第6章 創(chuàng)新性54-55
• 致謝55-56
• 參考文獻56-62
• 攻讀學位期間的研究成果62-63
• 綜述63-70
• 參考文獻68-70

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1 張靜怡;趙穎潔;李秀珍;方舒;何冰清;劉曦;羅軍;黃孝天;;酵母雙雜交篩選與CVB3 3A相互作用的人心臟蛋白[J];中國人獸共患病學報;2014年02期

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1 張靜怡;與CVB3 3A相互作用的人心臟蛋白的篩選及功能初探[D];南昌大學醫(yī)學院;2015年

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本文編號：298419