本文關(guān)鍵詞：超正電荷ZFN融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及其功能的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)是一種感染人類免疫系統(tǒng)的病毒,可通過破環(huán)人的淋巴細(xì)胞影響細(xì)胞免疫和體液免疫過程,導(dǎo)致免疫系統(tǒng)癱瘓,對人類健康存在極大威脅。最新的研究結(jié)果表明,CCR5受體是HIV進(jìn)入T細(xì)胞的共受體,因此破壞基因組中的CCR5基因或阻止CCR5基因表達(dá)成了阻斷HIV侵染人類T細(xì)胞的一種新途徑。本文運(yùn)用Ni磁珠與Co磁珠親和層析技術(shù)純化出超正電荷ZFN融合蛋白,驗(yàn)證出該蛋白具有切割CCR5基因的活性,從而為后續(xù)阻斷HIV進(jìn)入T細(xì)胞以及HIV基因治療提供了新思路。本文主要研究結(jié)果如下:1.超正電荷ZFN融合蛋白的表達(dá)運(yùn)用IPTG對轉(zhuǎn)化了p ET22b-(+)36GFP/ZFNL和p ET22b-(+)36YFP/ZFNR質(zhì)粒的兩種菌株進(jìn)行誘導(dǎo),然后分別在不同溫度和不同IPTG濃度的條件下過夜培養(yǎng),次日分別收集菌體進(jìn)行超聲破碎,SDS-PAGE檢測蛋白分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定16℃,0.5m M IPTG誘導(dǎo)是融合蛋白(+)36GFP/ZFNL和(+)36YFP/ZFNR表達(dá)的最適條件。2.超正電荷ZFN融合蛋白純化條件的摸索1)通過Ni磁珠親和層析技術(shù)純化+36GFP/ZFNL融合蛋白,發(fā)現(xiàn)高鹽裂解液條件有利于此融合蛋白掛柱,后續(xù)洗脫可以有效獲得該融合蛋白。2)+36YFP/ZFNR融合蛋白同樣在高鹽裂解液條件下有利于其掛柱,但后續(xù)洗脫困難,推測該融合蛋白與Ni磁珠結(jié)合過于牢固。然后運(yùn)用了Co磁珠和已使用兩次的Ni磁珠對該融合蛋白進(jìn)行純化,發(fā)現(xiàn)該方法可以有效獲得+36YFP/ZFNR融合蛋白。3.重組質(zhì)粒Pet22b/CCR5的構(gòu)建以HCC1954細(xì)胞中的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板,有效獲得人CCR5基因。隨后將CCR5目的基因連接到質(zhì)粒載體Pet22b,經(jīng)菌落PCR,雙酶切及基因測序等方法驗(yàn)證了CCR5基因無突變。4.超正電荷ZFN融合蛋白活性檢測將重組質(zhì)粒p ET22b/CCR5與上述純化的兩個(gè)超正電荷ZFN融合蛋白在37℃共孵育1h后,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,發(fā)現(xiàn)隨著超正電荷ZFN融合蛋白摩爾量的增加,重組質(zhì)粒p ET22b/CCR5被切割成線性質(zhì)粒產(chǎn)物的量也在增加,表明ZFN蛋白活性功能在增強(qiáng)。同時(shí),發(fā)現(xiàn)當(dāng)超正電荷ZFN融合蛋白摩爾量增加到7n M后,該蛋白會對重組質(zhì)粒p ET22b/CCR5產(chǎn)生非特異性切割。綜上所述,我們在大腸桿菌中成功表達(dá)了超正電荷ZFN融合蛋白(+)36GFP/ZFNL和(+)36YFP/ZFNR,并利用Ni親和層析技術(shù)對上述兩種融合蛋白進(jìn)行了純化。在此基礎(chǔ)上,本文還構(gòu)建了重組質(zhì)粒Pet22b/CCR5,驗(yàn)證了這一對超正電荷ZFN融合蛋白對靶基因的體外切割活性即ZFN融合蛋白對基因組DNA的編輯功能。本文為研究超正電荷ZFN融合蛋白在體內(nèi)的活性奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ),也為HIV基因治療方法提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：超正電荷ZFN融合蛋白 CCR5基因 HIV 親和層析技術(shù)
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;R373
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 第1章 綜述10-19
• 1.1 HIV的流行概況10
• 1.2 CCR510-12
• 1.3 以CCR5為目標(biāo)的HIV基因治療方法概況12-14
• 1.3.1 小分子阻礙物13
• 1.3.2 針對CCR5的單克隆抗體13
• 1.3.3 具有編輯作用的趨化因子13-14
• 1.3.4 鋅指核酸酶（ZFN）14
• 1.4 靶標(biāo)CCR5基因治療HIV的臨床研究進(jìn)展14-17
• 1.5 以+36GFP和+36YFP為載體的ZFN蛋白輸送系統(tǒng)17
• 1.6 選題依據(jù)和研究意義17-18
• 1.7 研究內(nèi)容及研究展望18-19
• 第2章 +36GFP-ZFNL融合蛋白的表達(dá)、純化及定量分析19-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 2.1.1 質(zhì)粒、菌株及試劑盒19
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑19-20
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-30
• 2.2.1 主要溶液、緩沖液及培養(yǎng)基的配置21-23
• 2.2.2 質(zhì)粒單雙酶切23-24
• 2.2.3 融合蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)24-26
• 2.2.4 小量體積條件下純化融合蛋白26-27
• 2.2.5 大量體積條件下純化融合蛋白27-29
• 2.2.6 蛋白濃度測定29-30
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-36
• 2.3.1 pET22b/+36GFP-ZFNL質(zhì)粒酶切驗(yàn)證30
• 2.3.2 BL21中+36GFP-ZFNL表達(dá)條件的優(yōu)化30-32
• 2.3.3 BL21中+36GFP-ZFNL純化方法的摸索32-34
• 2.3.4 +36GFP-ZFNL融合蛋白透析及濃縮34-35
• 2.3.5 +36GFP-ZFNL融合蛋白的濃度測定及其定量分析35-36
• 2.4 討論36-37
• 第3章 +36YFP-ZFNR融合蛋白的表達(dá)、純化及定量分析37-44
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料37
• 3.1.1 質(zhì)粒、菌株及試劑盒37
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑37
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備37
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法37
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-43
• 3.3.1 pET22b/+36YFP-ZFNR質(zhì)粒酶切驗(yàn)證37-38
• 3.3.2 BL21中+36YFP-ZFNR融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化38-39
• 3.3.3 BL21中+36YFP-ZFNR融合蛋白的純化39-42
• 3.3.4 +36YFP-ZFNR融合蛋白的濃度測定及定量分析42-43
• 3.4 討論43-44
• 第4章 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b/CCR544-62
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料44-45
• 4.1.1 質(zhì)粒、菌株及試劑盒44
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑44-45
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備45
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法45-55
• 4.2.1 培養(yǎng)HCC1954細(xì)胞并提取其基因組DNA45-46
• 4.2.2 CCR5目的基因片段的制備46-52
• 4.2.3 pET22b載體的制備52
• 4.2.4 pET22b/CCR5重組質(zhì)粒的連接構(gòu)建52-53
• 4.2.5 pET22b/CCR5鑒定-菌落PCR53-54
• 4.2.6 pET22b/CCR5鑒定-雙酶切54-55
• 4.2.7 pET22b/CCR5鑒定-測序55
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-60
• 4.3.1 培養(yǎng)HCC1954細(xì)胞并提取其基因組DNA55-56
• 4.3.2 PCR擴(kuò)增目的片段及純化回收56-57
• 4.3.3 載體pET22b、PCR產(chǎn)物的雙酶切后的純化回收57-58
• 4.3.4 陽性重組質(zhì)粒pET22b/CCR5的構(gòu)建、篩選及鑒定58-60
• 4.4 討論60-62
• 第5章 +36GFP-ZFNL和+36YFP-ZFNR融合蛋白體外活性檢測62-67
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料62-63
• 5.1.1 蛋白、質(zhì)粒及試劑62
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備62-63
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法63-64
• 5.2.1 配置reaction buffer緩沖液63
• 5.2.2 梯度稀釋超正電荷ZFN融合蛋白至所需濃度63-64
• 5.2.3 超正電荷ZFN融合蛋白體外活性檢測64
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果64-65
• 5.3.1 超正電荷ZFN融合蛋白作用于重組質(zhì)粒pET22b/CCR564-65
• 5.3.2 反復(fù)凍融對超正電荷ZFN融合蛋白活性的影響65
• 5.4 討論65-67
• 結(jié)論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-71
• 致謝71

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王璋瑜;;蛋白設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室公司買下融合蛋白技術(shù)實(shí)用權(quán)[J];生物技術(shù)通報(bào);1990年10期

2 張毅,屈賢銘,楊勝利;融合蛋白基因工程應(yīng)用及研究[J];生物工程進(jìn)展;2000年03期

3 楊林,李國清,黃葆英,王全忠,龍綮新,王s閼

本文編號：298244