目的：研究與HBV的調(diào)控基因EnhⅠ、SPⅠ、SPⅡ結(jié)合的肝細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)因子，以進(jìn)一步了解HBV嗜肝性的分子生物學(xué)機制，為探索特異性更強的基因治療技術(shù)奠定基礎(chǔ)及進(jìn)一步的治療應(yīng)用創(chuàng)造條件。 方法：（1）應(yīng)用噬菌體表面展示技術(shù)分別以生物素化的HBV增強子Ⅰ（EnhⅠ）、HBV表面抗原啟動子Ⅰ（SPⅠ）、HBV表面抗原啟動子Ⅱ（SPⅡ）PCR產(chǎn)物作為固相篩選分子，對噬菌體人肝細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行4輪“吸附-洗脫-擴增”過程，經(jīng)噬斑的PCR擴增后，構(gòu)建T-A克隆載體，最后對所篩選克隆進(jìn)行DNA序列分析和同源性搜索，確定EnhⅠ、SPⅠ、SPⅡ DNA結(jié)合蛋白。（2）將篩選到的HBV SPⅡ結(jié)合蛋白之一的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基4（NADHDH4），根據(jù)其全基因編碼序列，設(shè)計引物，以人肝癌細(xì)胞基因組為模板，經(jīng)PCR得到NADHDH4的全基因編碼序列，將其構(gòu)建到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（-）中。將HBV SPⅡ啟動子構(gòu)建到氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）報告基因載體中，二者共轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2，用ELISA法檢測氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）的表達(dá)。 結(jié)果：（1）噬菌體經(jīng)... 

【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

Lane:200aer部分陽性噬斑裂解液PCR擴增Lanel一5:第4陽噬裂PCR果

一一一一一一一一一一一一蘭翌遐盆_確，DNA片段大小為138bP。成功擴增了HBvsPI啟動子DNA片段。(結(jié)果見圖2一l)1234567892000bP-~138bP圖2一1HBVSPIPCR擴增Lanel:2000bPmarker;LaneZ一9:SPIPCR結(jié)果2.肝細(xì)胞cDNA文庫的篩選以固相化的SPI啟動子DNA片段作為支持分子，對肝細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行4輪“吸附一洗脫一擴增”的篩選。噬菌體的富集結(jié)果見表2一1。從固相平板洗脫的噬菌體數(shù)顯示了明顯的增加趨勢，第4輪與第1輪相比，富集了356倍(富集倍數(shù)=第4輪產(chǎn)出率/第1輪產(chǎn)出率)。表2一l親和篩選對噬菌體的富集篩選次數(shù)噬菌體數(shù)投入產(chǎn)出率捕獲第1輪第2輪第3輪第4輪3.5xl082.5x10112.6x10151.sx10202.sxloll2.6x10151.sxl02o3.sx10257.1x1021.ox1045.8x1042.5xl05注:產(chǎn)出率=捕獲的噬菌體數(shù)量/投入的噬菌體數(shù)量3.目的基因的PCR擴增經(jīng)過4輪篩選，隨機挑取14個陽性噬斑為模板，用T7selectPcR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果產(chǎn)生片段大小不等的條帶(圖2一2)，裂解液重復(fù)PCR得到相同結(jié)果。.PCR擴增，用同一噬斑引

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文M2000123456782000bP-250bP-圖2-2LaneM:2000盯拐Ifker陽性噬斑裂解液PCR擴增Lanel一8:第4輪陽性噬斑裂解液PCR4.序列比對和同源性分析對陽性克隆基因的DNA序列測定，及根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行BLASTn同源性搜索，8個陽性克隆篩選到啟動子DNA結(jié)合蛋白，共編碼7種蛋白。其中3個克隆編碼未知功能蛋白;其余的克隆分別編碼4一氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶、觸珠蛋白、復(fù)制蛋白等蛋白，結(jié)果見表2一2。表2一2應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選到的陽性克隆編號同源性99%100%99%99%100%100%100%克隆數(shù)編碼蛋白isolate183而toehondrion(孤立線粒體183)RF~C/aetivator1homolog(釋放因子C/激活因子l同源體)hypothetiealproteinMGC9515(人類假想蛋白MGC9515)Haptoglobin(觸珠蛋白)4一a而nobutyratea而notransferase(4一氨基T酸氨基轉(zhuǎn)移酶)ehromosome3eloneRPll一801L18(復(fù)制蛋白11一80lL18)hypothetiealproteinFI日22056(人類假想蛋白日J(rèn)22056)討論噬菌體展示技術(shù)是一種基因表達(dá)產(chǎn)物與親和選擇相結(jié)合的技術(shù)，基本原理及操作過程為:以改構(gòu)的噬菌體為載體，把待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白基因區(qū)，如在噬菌體蛋白lll(pIII)和蛋白姍(P姍)等衣殼蛋白基因區(qū)的N一端插入外源基因，形成


本文編號：2965916