本文關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌烯醇化酶與熱休克蛋白DnaJ相互作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：明確肺炎鏈球菌糖酵解關(guān)鍵酶烯醇化酶(enolase, Eno)與熱休克蛋白DnaJ是否有直接結(jié)合及結(jié)合位點(diǎn),初步探討DnaJ蛋白對(duì)Eno蛋白胞內(nèi)蛋白水平及胞外分泌的影響。方法：原核表達(dá)并純化Eno全長(zhǎng)蛋白,鑒定其酶活性,利用重組Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠制備特異性抗血清,分析其蛋白表達(dá)及胞外分泌情況；采用生物膜層干涉(biolayer interferometrvy, BLI)技術(shù)和直接結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定Eno和DnaJ兩者之間是否存在直接相互作用；在前者結(jié)果陽性的基礎(chǔ)上,截短表達(dá)Eno蛋白,通過直接結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定Eno蛋白結(jié)合DnaJ的位點(diǎn)。根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)果,構(gòu)建一系列異位表達(dá)的重組pJWv25-eno截短片段,轉(zhuǎn)化肺炎鏈球菌R6菌株,Western blot檢測(cè)各片段的胞內(nèi)及胞外蛋白水平,分析DnaJ的結(jié)合對(duì)Eno蛋白水平的影響。在肺炎鏈球菌中過表達(dá)DnaJ蛋白,通過Western blot檢測(cè)Eno蛋白的胞內(nèi)及胞外蛋白水平,進(jìn)一步鑒定DnaJ對(duì)Eno蛋白胞內(nèi)蛋白水平及分泌的影響。結(jié)果：成功表達(dá)重組Eno蛋白,純度達(dá)90%,該蛋白具有a-Eno酶活性；重組Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠后,獲得效價(jià)達(dá)1：7.68×106的特異性抗血清；Western blot分析顯示,7種不同血清型肺炎鏈球菌培養(yǎng)上清中均在分子量約47 kD處出現(xiàn)特異性反應(yīng)帶；直接結(jié)合試驗(yàn)顯示,隨著Eno蛋白量的增加,Eno與DnaJ的結(jié)合量也相應(yīng)增加(r=0.920,P=0.000),其吸光度值從0.222±0.042(1.25μg)增加到0.569±0.099(20.0 μg)；BLI技術(shù)測(cè)定兩者結(jié)合的親和常數(shù)為926nmol/L;截短的Eno(aa1-aa100)與DnaJ的結(jié)合量2.25±0.38高于其他截短序列的結(jié)合量0.94±0.25、1.08±0.09、0.75±0.12,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000,P=0.001,P=0.000)。Western blot結(jié)果顯示,各截短片段均能在肺炎鏈球菌胞內(nèi)表達(dá),僅片段Eno3及Eno4可在培養(yǎng)上清中被檢測(cè)；過表達(dá)DnaJ情況下,肺炎鏈球菌中胞內(nèi)的Eno蛋白水平無明顯變化,培養(yǎng)上清中的Eno蛋白量減少。結(jié)論：肺炎鏈球菌Eno蛋白與DnaJ蛋白存在直接結(jié)合作用,結(jié)合位點(diǎn)主要位于其N端的1-100個(gè)氨基酸序列。DnaJ蛋白與Eno蛋白的結(jié)合能力強(qiáng)弱與Eno蛋白的分泌能力無關(guān),但DnaJ過表達(dá)可降低Eno蛋白的胞外分泌水平。
【關(guān)鍵詞】：肺炎鏈球菌 烯醇化酶 DnaJ 蛋白相互作用
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378.14
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對(duì)照5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分 肺炎鏈球菌烯醇化酶與熱休克蛋白DnaJ結(jié)合及結(jié)合位點(diǎn)鑒定14-30
• 1 材料與方法14-20
• 2 結(jié)果20-27
• 3 討論27-30
• 第二部分 肺炎鏈球菌熱休克蛋白DnaJ對(duì)烯醇化酶胞內(nèi)蛋白量及胞外分泌的影響30-37
• 1 材料與方法30-32
• 2 結(jié)果32-35
• 3 討論35-37
• 全文總結(jié)37-38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 文獻(xiàn)綜述41-49
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 致謝49-50
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文50

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