本文關鍵詞：肺炎鏈球菌烯醇化酶與熱休克蛋白DnaJ相互作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：明確肺炎鏈球菌糖酵解關鍵酶烯醇化酶(enolase, Eno)與熱休克蛋白DnaJ是否有直接結合及結合位點,初步探討DnaJ蛋白對Eno蛋白胞內(nèi)蛋白水平及胞外分泌的影響。方法：原核表達并純化Eno全長蛋白,鑒定其酶活性,利用重組Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠制備特異性抗血清,分析其蛋白表達及胞外分泌情況；采用生物膜層干涉(biolayer interferometrvy, BLI)技術和直接結合實驗鑒定Eno和DnaJ兩者之間是否存在直接相互作用；在前者結果陽性的基礎上,截短表達Eno蛋白,通過直接結合實驗鑒定Eno蛋白結合DnaJ的位點。根據(jù)結合位點結果,構建一系列異位表達的重組pJWv25-eno截短片段,轉化肺炎鏈球菌R6菌株,Western blot檢測各片段的胞內(nèi)及胞外蛋白水平,分析DnaJ的結合對Eno蛋白水平的影響。在肺炎鏈球菌中過表達DnaJ蛋白,通過Western blot檢測Eno蛋白的胞內(nèi)及胞外蛋白水平,進一步鑒定DnaJ對Eno蛋白胞內(nèi)蛋白水平及分泌的影響。結果：成功表達重組Eno蛋白,純度達90%,該蛋白具有a-Eno酶活性；重組Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠后,獲得效價達1：7.68×106的特異性抗血清；Western blot分析顯示,7種不同血清型肺炎鏈球菌培養(yǎng)上清中均在分子量約47 kD處出現(xiàn)特異性反應帶；直接結合試驗顯示,隨著Eno蛋白量的增加,Eno與DnaJ的結合量也相應增加(r=0.920,P=0.000),其吸光度值從0.222±0.042(1.25μg)增加到0.569±0.099(20.0 μg)；BLI技術測定兩者結合的親和常數(shù)為926nmol/L;截短的Eno(aa1-aa100)與DnaJ的結合量2.25±0.38高于其他截短序列的結合量0.94±0.25、1.08±0.09、0.75±0.12,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000,P=0.001,P=0.000)。Western blot結果顯示,各截短片段均能在肺炎鏈球菌胞內(nèi)表達,僅片段Eno3及Eno4可在培養(yǎng)上清中被檢測；過表達DnaJ情況下,肺炎鏈球菌中胞內(nèi)的Eno蛋白水平無明顯變化,培養(yǎng)上清中的Eno蛋白量減少。結論：肺炎鏈球菌Eno蛋白與DnaJ蛋白存在直接結合作用,結合位點主要位于其N端的1-100個氨基酸序列。DnaJ蛋白與Eno蛋白的結合能力強弱與Eno蛋白的分泌能力無關,但DnaJ過表達可降低Eno蛋白的胞外分泌水平。
【關鍵詞】：肺炎鏈球菌 烯醇化酶 DnaJ 蛋白相互作用
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378.14
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分 肺炎鏈球菌烯醇化酶與熱休克蛋白DnaJ結合及結合位點鑒定14-30
• 1 材料與方法14-20
• 2 結果20-27
• 3 討論27-30
• 第二部分 肺炎鏈球菌熱休克蛋白DnaJ對烯醇化酶胞內(nèi)蛋白量及胞外分泌的影響30-37
• 1 材料與方法30-32
• 2 結果32-35
• 3 討論35-37
• 全文總結37-38
• 參考文獻38-41
• 文獻綜述41-49
• 參考文獻45-49
• 致謝49-50
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文50

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