本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌基因PA4591及操縱子PA4591-PA4594的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：銅綠假單胞菌是一類(lèi)重要的革蘭氏陰性機(jī)會(huì)致病菌,是導(dǎo)致院內(nèi)感染的主要病原微生物。該病原菌是免疫缺陷患者(如HIV患者、肺囊腫纖維化病人、燒傷患者等)發(fā)生高發(fā)病率和高死亡率的主要原因。然而由于其自身所具備的極強(qiáng)的內(nèi)在抗藥性和獲得性耐藥,使得醫(yī)院對(duì)感染了銅綠假單胞菌的病人的治療過(guò)程變得非常困難。因此在優(yōu)化臨床用藥和采用新型殺菌劑的治療中必須首先弄清楚銅綠假單胞菌耐藥性產(chǎn)生的原因和致病機(jī)理,從基因水平進(jìn)行深入研究。實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)利用碳青霉烯類(lèi)中的三種代表性的抗生素(美羅培南、亞胺培南和比亞培南)對(duì)包含3萬(wàn)多株轉(zhuǎn)座子隨機(jī)標(biāo)記的銅綠假單胞菌突變體庫(kù)進(jìn)行篩選,得到了多個(gè)與碳青霉烯類(lèi)敏感與耐藥相關(guān)基因。其中的一株轉(zhuǎn)座突變體PA4591對(duì)碳青霉烯類(lèi)的抗性增加了四倍。本課題關(guān)注該基因PA4591及該基因所組成的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子產(chǎn)生耐藥的原因和基因功能,并做了一系列的研究。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在突變體PAO1(△4591)中,藥物外排泵mexAB-oprM的表達(dá)是野生型中的兩倍多,mexAB-oprM表達(dá)的增加有可能是PAO1(△4591)對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐受性增高的重要原因。突變體PAO1(△4591)中,PQS的產(chǎn)量明顯降低。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)綠膿菌素的量和突變體PAO1(△4591)水解蛋白的能力也明顯減少。而在銅綠假單胞菌中,蛋白水解酶和綠膿菌素是兩類(lèi)重要的毒力因子。實(shí)驗(yàn)通過(guò)果蠅喂食感染模型和白菜模型證實(shí)突變體PAO1(△4591)的致病性降低。PA4591在維持銅綠假單胞菌的致病能力方面也有著不可或缺的作用。對(duì)PA4591的基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行分析預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于HlyD家族分泌蛋白,而且該基因與PA4592、PA4593和PA4594共同構(gòu)成一個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子,其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物涉及到對(duì)溶血素的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。溶血素作為一類(lèi)重要的毒力因子,尚未在銅綠假單胞菌中的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究。研究中發(fā)現(xiàn)突變體PAO1(△4591)、PAO1(△4592)和PAO1(△4593)使銅綠假單胞菌喪失溶血能力,證明該ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子對(duì)于銅綠假單胞菌溶血素的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程具有至關(guān)重要的作用。然而,PA4594的突變體PAO1(△4594)仍然具有溶血活性。這并非說(shuō)明溶血素的轉(zhuǎn)運(yùn)不需要能量,有可能也存在其它形式的能量為銅綠假單胞菌溶血素的轉(zhuǎn)運(yùn)提供動(dòng)力,銅綠假單胞菌溶血素轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中能量的供應(yīng)來(lái)源仍有待進(jìn)一步細(xì)致的研究。此外,實(shí)驗(yàn)還對(duì)各突變體PAO1(△4592)、PAO1(△4593)和PAO1(△4594)的碳青霉烯類(lèi)抗生素的敏感程度進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)PAO1(△4592)、PAO1(△4593)對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素表現(xiàn)出明顯的耐受性,而PAO1(△4594)的耐藥表型與野生型PA01一致,由此也說(shuō)明溶血素的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程與銅綠假單胞菌的耐藥性緊密關(guān)聯(lián)。該ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子對(duì)銅綠假單胞菌的生理生化功能有重要影響。
【關(guān)鍵詞】：ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子 耐藥性 銅綠假單胞菌 致病性 碳青霉烯類(lèi)抗生素
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R378
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-12
• 縮略語(yǔ)比對(duì)表12-13
• 第一部分 引言13-23
• 1.1 銅綠假單胞菌的耐藥性13
• 1.2 碳青霉烯類(lèi)抗生素13-14
• 1.3 銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥機(jī)制研究進(jìn)展14-16
• 1.4 銅綠假單胞菌的致病性16-18
• 1.5 細(xì)菌中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)18-21
• 1.5.1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子的結(jié)構(gòu)19-20
• 1.5.2 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制20
• 1.5.3 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子在微生物耐藥性與致病性方面的研究20-21
• 1.6 研究?jī)?nèi)容及意義21-23
• 第二部分 材料和方法23-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-27
• 2.1.1 質(zhì)粒、菌株和引物23-25
• 2.1.2 培養(yǎng)基和緩沖液25-26
• 2.1.3 試劑26-27
• 2.1.4 儀器27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-37
• 2.2.1 銅綠假單胞菌感受態(tài)細(xì)胞的制備27-28
• 2.2.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備28
• 2.2.3 質(zhì)粒提取28-29
• 2.2.4 瓊脂糖凝膠核酸片段回收純化29
• 2.2.5 酶切與連接29
• 2.2.6 電轉(zhuǎn)化29-30
• 2.2.7 構(gòu)建敲除突變體30-32
• 2.2.8 基因敲除突變體的互補(bǔ)32-33
• 2.2.9 抗生素敏感性的檢測(cè)33
• 2.2.10 抗生素最低抑制濃度(MIC)的檢測(cè)33-34
• 2.2.11 外排泵表達(dá)水平的測(cè)定34
• 2.2.12 溶血能力的測(cè)定測(cè)定34
• 2.2.13 PQS的提取及薄層層析34-35
• 2.2.14 綠膿菌素的測(cè)定35
• 2.2.15 蛋白水解酶活性檢測(cè)35
• 2.2.16 果蠅模型檢測(cè)致病性35-36
• 2.2.17 白菜模型檢測(cè)致病性36-37
• 第三部分 結(jié)果37-51
• 3.1 PA4591基因功能的研究37-45
• 3.1.1 基因PA4591的相關(guān)信息37
• 3.1.2 基因PA4591的敲除與互補(bǔ)37-39
• 3.1.3 基因PA4591涉及到對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的敏感性39-40
• 3.1.4 突變體中mexAB外排泵表達(dá)增加40
• 3.1.5 雙突變體PAO1(△4591△mexAB)的構(gòu)建40-41
• 3.1.6 PAO1(△4591)喪失溶血能力41-42
• 3.1.7 PAO1(△4591)中PQS產(chǎn)量明顯降低42-43
• 3.1.8 PA4591突變影響綠膿菌素的合成43-44
• 3.1.9 PA4591突變影響蛋白水解酶活性44
• 3.1.10 PAO1(△4591)降低銅綠假單胞菌的致病能力44-45
• 3.2 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子PA4591-PA4594功能的初步探索45-51
• 3.2.1 操縱子PA4591-PA4594的生物信息學(xué)分析46-48
• 3.2.2 基因PA4592、PA4593和PA4594敲除突變體的構(gòu)建48-49
• 3.2.3 PAO1(△4592)、PA01(△4593)和PAO1(△4594)溶血能力的檢測(cè)49-50
• 3.2.4 PAO1(△4592)、PA01(△4593)和PAO1(△4594)抗生素敏感性的變化50-51
• 第四部分 總結(jié)與討論51-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的成果62-63
• 致謝63

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王波波;銅綠假單胞菌基因PA4591及操縱子PA4591-PA4594的功能研究[D];西北大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌基因PA4591及操縱子PA4591-PA4594的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：289423