本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲入侵宿主細(xì)胞過程中棒狀體蛋白16的分泌與分布，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的觀察剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)不同毒力株的棒狀體蛋白16(ROP16)在入侵宿主細(xì)胞過程中的分泌及分布。方法以剛地弓形蟲RH株速殖子c DNA為模板,PCR擴(kuò)增Tgrop16基因,克隆至p ET-32a(+)載體,在大腸埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。重組蛋白Tg ROP16經(jīng)純化后免疫新西蘭大白兔,制備抗Tg ROP16多克隆抗體,用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)和間接ELISA檢測(cè)抗Tg ROP16多克隆抗體的特異性和敏感性。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)剛地弓形蟲RH株和Pru株速殖子Tgrop16基因的轉(zhuǎn)錄水平,Western blotting分析RH株和Pru株Tg ROP16蛋白的表達(dá)量。用間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)弓形蟲RH株和Pru株速殖子在入侵人包皮成纖維細(xì)胞(HFFs細(xì)胞)過程中,Tg ROP16蛋白在宿主細(xì)胞中的分泌與分布。結(jié)果制備的抗Tg ROP16多克隆抗體,Western blotting分析結(jié)果顯示,能與重組蛋白Tg ROP16結(jié)合,在相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約100 000處有一特異性條帶;間接ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,抗體效價(jià)為1∶25 600。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,Pru株Tgrop16基因表達(dá)量(7.786±0.206)是RH株(1.000±0.110)的7倍(P0.05)。Western blotting分析結(jié)果顯示,RH株中Tg ROP16蛋白表達(dá)量(Tg ROP16與其內(nèi)參Tg Tubulin的灰度比值為0.373)較高于Pru株(Tg ROP16與其內(nèi)參Tg Tubulin的灰度比值為0.232)。IFA檢測(cè)結(jié)果顯示,RH株和Pru株速殖子在入侵HFFs細(xì)胞前,Tg ROP16蛋白定位于速殖子的頂端復(fù)合體,速殖子入侵HFFs細(xì)胞后,Tg ROP16蛋白顯示在蟲體外。結(jié)論制備的抗Tg ROP16多克隆抗體特異性和敏感性高;剛地弓形蟲RH株速殖子的Tg ROP16蛋白表達(dá)量高于Pru株的;兩株速殖子在入侵HFFs細(xì)胞前,Tg ROP16蛋白分布于速殖子頂端復(fù)合體,在入侵宿主細(xì)胞過程中被分泌出蟲體。
【作者單位】： 南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院廣東省熱帶病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 病原生物學(xué)系暨廣東省普通高校新發(fā)傳染病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【關(guān)鍵詞】： 剛地弓形蟲 棒狀體蛋白 多克隆抗體 制備 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 間接免疫熒光 蛋白質(zhì)印跡
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81572012,81271866) 廣東省高校珠江學(xué)者特聘教授配套經(jīng)費(fèi)(2014)~~
【分類號(hào)】：R382.5
【正文快照】： immunofluorescence assay(IFA).Results Western blotting showed a specific band at Mrof~100 000,indicatingthat the specific rabbit-derived anti-Tg ROP16 polyclonal antibody was capable of recognizing Tg ROP16.IndirectELISA revealed a titer of 1:25 600 for

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本文編號(hào)：289295