本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲RH株ROP10基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫原性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:弓形蟲(Toxoplasma gondii)是世界性分布的寄生蟲。該蟲是重要的機(jī)會(huì)性致病原蟲,寄生于人體及動(dòng)物的有核細(xì)胞內(nèi),可感染人體和全球200多種動(dòng)物,引起弓形蟲病。據(jù)估計(jì)全世界30%的人群感染本蟲。免疫功能低下和新生兒是弓形蟲病的最大受害者,可引起嚴(yán)重的后果,直接影響到人類的健康和社會(huì)的發(fā)展,同時(shí)對食品公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)也造成了一定程度的隱患和危害,而目前尚沒有理想的防治弓形蟲病的藥物,所以研制安全有效的疫苗預(yù)防該病尤為重要。研究表明弓形蟲棒狀體蛋白由棒狀體分泌,對弓形蟲侵入宿主細(xì)胞并對其發(fā)揮毒力方面均起著重要的作用,在疫苗研制方面具有很大的潛力。本研究通過分子生物學(xué)方法構(gòu)建了重組質(zhì)粒p VAX1-ROP10,并將其肌肉注射免疫BALB/c小鼠,為進(jìn)一步研究弓形蟲ROP10基因核酸疫苗提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:提取弓形蟲RH株速殖子總RNA,根據(jù)已發(fā)表的ROP10基因序列(登錄號為DQ124368)設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行ROP10基因的逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增,將擴(kuò)增的目的片段ROP10基因克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒p VAX1上,構(gòu)建重組質(zhì)粒p VAX1-ROP10,并通過菌落PCR、酶切分析、基因測序的方法對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到制備好的感受態(tài)大腸埃希菌(E.coli)XL1-Blue內(nèi),篩選陽性克隆后擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒,之后通過lipofectamine陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將p VAX1-ROP10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至He La細(xì)胞內(nèi),提取He La細(xì)胞的總RNA,分別進(jìn)行β-acting基因和ROP10基因的RT-PCR擴(kuò)增,其RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳驗(yàn)證以檢驗(yàn)ROP10基因是否在He La細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。將重組質(zhì)粒通過肌肉注射方式免疫8周齡BALB/C小鼠,每隔兩周免疫一次,在每次注射免疫前和末次注射免疫后的第二周采集小鼠血清,采用間接ELISA法檢測血清中抗體Ig G水平和細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10)的水平,并觀察各組小鼠的存活時(shí)間。結(jié)果:經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增ROP10基因產(chǎn)物為1761 bp,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒p VAX1-ROP10,并經(jīng)菌落PCR、Eco R I和Not I雙酶切分析和基因測序得到證實(shí)。將重組質(zhì)粒p VAX1-ROP10轉(zhuǎn)染至He La細(xì)胞并提取總RNA后,β-actin基因和ROP10基因的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證分別在613bp處和1761bp處有明亮條帶,與預(yù)期片段大小相符,證明了ROP10能夠在體外真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。小鼠免疫接種后,實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中的Ig G抗體隨著免疫次數(shù)的增加而有明顯地升高,但空質(zhì)粒對照組、PBS對照組和空白對照組相應(yīng)的血清中均未出現(xiàn)明顯升高。末次免疫后2周,實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中Ig G抗體水平明顯升高,與其他對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的水平(pg/ml),實(shí)驗(yàn)組分別為465.31±12.21、168.52±11.22、150.35±11.34、166.00±12.34。空質(zhì)粒組分別為50.32±6.73、48.63±6.02、52.00±6.83、53.67±5.94。PBS對照組分別為47.02±4.68、42.34±5.24、47.30±5.23、50.63±5.94�？瞻讓φ战M分別為48.39±5.23、46.32±5.25、49.23±7.84、50.00±6.82。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞因子水平明顯升高,與空質(zhì)粒對照組、PBS對照組和空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。抗感染免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明,與其它對照組比較,實(shí)驗(yàn)組小鼠平均存活時(shí)間明顯延長(P0.05)。結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了ROP10表達(dá)載體p VAX1-ROP10,并成功在He La細(xì)胞中表達(dá),用p VAX1-ROP10重組質(zhì)粒對小鼠進(jìn)行免疫后能增強(qiáng)小鼠的免疫應(yīng)答,為ROP10核酸疫苗的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：剛地弓形蟲 ROP10 真核表達(dá)質(zhì)粒 免疫反應(yīng) 核酸疫苗
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R382.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文縮寫9-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-26
• 結(jié)果26-29
• 附圖29-36
• 附表36-37
• 討論37-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 綜述43-55
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 致謝55-56
• 個(gè)人簡歷56-57

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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  本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲RH株ROP10基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫原性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：289243