本文關(guān)鍵詞：Jnk2通過smARF的降解來調(diào)控壓力誘導(dǎo)的線粒體自噬及組織損傷，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自噬是一個自我清理的過程,通過細胞質(zhì)蛋白質(zhì)和細胞器被隔離在一個雙層膜自噬體中,然后它通過與溶酶體融合形成自噬溶酶體來降解細胞質(zhì)蛋白,大分子和細胞器,從而實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。我們將細胞通過自噬機制清除受損或不需要的線粒體的途徑稱為線粒體自噬,這里我們將研究重點放在線粒體自噬上。線粒體自噬是一個特異性的選擇過程,并受到各種因子的精密調(diào)節(jié),對維持細胞的動態(tài)平衡是至關(guān)重要的,但是其詳細的調(diào)控機制在很大程度上是未知的。線粒體自噬的異常調(diào)控已經(jīng)涉及到許多疾病和病理生理活動。眾多研究表明JNK信號通路在人類疾病中發(fā)揮十分重要和復(fù)雜的作用。它在細胞周期、生殖、凋亡和細胞應(yīng)激等多種生理過程中也起到了很重要的作用。JNK是c-Jun氨基末端激酶又稱應(yīng)激活化蛋白激酶,JNK蛋白激酶由三個基因編碼,JNK1、JNK2和JNK3。JNK1和JNK2基因在全身廣泛表達,而JNK3呈限制性表達。我們的研究表明,在細胞壓力或外界條件刺激下,JNK2通過調(diào)節(jié)sm ARF蛋白的表達誘導(dǎo)了細胞線粒體自噬。sm ARF是在線粒體上特異性表達的腫瘤抑制蛋白ARF的亞型形式,也可以說是在線粒體上特異性表達的腫瘤抑制蛋白ARF的可變剪切亞型。有研究表明通過外源過度表達sm ARF蛋白水平能誘導(dǎo)線粒體的去極化和隨后的線粒體自噬。在這篇文章中,我們發(fā)現(xiàn)JNK2能促進sm ARF蛋白的泛素化,導(dǎo)致了內(nèi)源sm ARF蛋白通過蛋白酶體途徑降解。在JNK2缺陷型細胞中,sm ARF蛋白的失調(diào)導(dǎo)致了其在細胞中過多的積累,從而抑制了壓力誘導(dǎo)的線粒體自噬活性,使受損的線粒體不能通過線粒體自噬被清除,進而積累了過多的線粒體活性氧(ROS)。有文章報道表明線粒體自噬缺陷能夠產(chǎn)生過多的活性氧(ROS),而過多的活性氧(ROS)可以導(dǎo)致炎癥的過度活化。在這篇文章中我們又發(fā)現(xiàn),在缺氧壓力下,JNK2基因缺陷的小鼠顯示有缺陷的線粒體自噬,導(dǎo)致組織損傷。我們的研究發(fā)現(xiàn)能一種新穎的維持免疫穩(wěn)態(tài)機制,通過這種機制進而保護組織的損傷,這為更進一步了解一些疾病的治療策略提供了一定的參考價值。
【關(guān)鍵詞】：線粒體自噬 JNK2 smARF 組織損傷 泛素化
【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 1 研究背景8-13
• 1.1 線粒體自噬8-9
• 1.1.1 細胞自噬和線粒體自噬8-9
• 1.1.2 線粒體自噬的機制9
• 1.2 JNK信號通路9-10
• 1.3 smARF和泛素蛋白酶體途徑10-11
• 1.3.1 smARF10-11
• 1.3.2 泛素蛋白酶體途徑11
• 1.4 研究目的和意義11-13
• 2 實驗材料13-15
• 2.1 細胞系13
• 2.2 質(zhì)粒和細菌13
• 2.3 siRNA的合成和序列13-14
• 2.4 實驗試劑14
• 2.5 抗體信息14
• 2.6 小鼠14-15
• 3 實驗方法15-29
• 3.1 質(zhì)粒和siRNA的轉(zhuǎn)染（6 孔板）15
• 3.2 Western blot15-17
• 3.2.1 細胞中的蛋白樣品 (以六孔板為例)15-16
• 3.2.2 組織中的蛋白樣品16
• 3.2.3 制膠和電泳16
• 3.2.4 轉(zhuǎn)膜和封閉16-17
• 3.2.5 抗體孵育和顯影17
• 3.3 免疫共沉淀CO-IP17-19
• 3.3.1 鋪板17
• 3.3.2 準備beads17-18
• 3.3.3 樣品抗體共孵育18
• 3.3.4 CO-IP樣品的制備18
• 3.3.5 蛋白檢測18-19
• 3.4 泛素化實驗19
• 3.5 細胞質(zhì)和細胞核的抽提19-20
• 3.5.1 樣品的制備19-20
• 3.5.2 細胞質(zhì)與細胞核的抽提20
• 3.6 線粒體/細胞質(zhì)的分離抽提20-22
• 3.6.1 實驗準備21
• 3.6.2 細胞抽提21-22
• 3.7 轉(zhuǎn)化22
• 3.8 質(zhì)粒DNA提取22-26
• 3.8.1 少量質(zhì)粒DNA的抽提22-23
• 3.8.2 大量質(zhì)粒DNA的提取23-26
• 3.9 線粒體活性氧（ROS）的測量26
• 3.10 熒光顯微鏡(Fluorescence microscopy)26-27
• 3.11 體內(nèi)實驗27
• 3.12 穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建27-29
• 4 結(jié)果29-44
• 4.1 JNK2 對壓力誘導(dǎo)的線粒體自噬是必要的29-31
• 4.2 JNK2 能不依賴于PINK1/Parkin途徑正調(diào)節(jié)線粒體自噬31-33
• 4.3 JNK2 的缺失能穩(wěn)定smARF蛋白33-35
• 4.4 JNK2 能促進smARF蛋白的泛素化和降解35-38
• 4.5 JNK2 能減緩缺氧誘導(dǎo)的組織損傷38-41
• 補充數(shù)據(jù)41-44
• 5 討論44-46
• 6 結(jié)論46-47
• 參考文獻47-51
• 攻讀學位期間的研究成果51-52
• 致謝52-53

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本文編號：289056