發(fā)布時(shí)間：2020-11-15 05:04

　　 目的：構(gòu)建pcDNA3.1(+)人促甲狀腺激素受體（hTSHR）基因真核表達(dá)載體，并在COS-7細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，為進(jìn)一步研究hTSHR的生物學(xué)功能，以及利用hTSHR真核表達(dá)載體建立Graves病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。 方法：以限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I雙酶切質(zhì)粒pBluescript SK(-)/hTSHR，獲得hTSHR cDNA的全長片段，在以低熔點(diǎn)瓊脂糖回收純化后，定向插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位點(diǎn)中，構(gòu)建重組體pcDNA3.1/hTSHR，進(jìn)行酶切、PCR及DNA測序鑒定。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，以重組質(zhì)粒pcDNA3.1/hTSHR 轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，并用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測被轉(zhuǎn)染細(xì)胞hTSHR的表達(dá)情況。 結(jié)果：雙酶切pBluescript SK(-)/hTSHR得到一約2.7 kb含有 TSHR全長cDNA的片段，同預(yù)期片段的大小相符。所構(gòu)建的pcDNA3.1/hTSHR經(jīng)雙酶切及PCR鑒定同預(yù)期大小相符，測序結(jié)果與GenBank中收錄的hTSHR cDNA全長序列一致，表明hTSHR真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測表明，細(xì)胞可以表達(dá)hTSHR并具有抗原性。 結(jié)論：成功地構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/hTSHR，hTSHR WP=8 體外表達(dá)體系的建立，有利于下一步利用hTSHR真核表達(dá)載體建立Graves病動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究Graves病的發(fā)病機(jī)理及治療打下一定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
符號(hào)說明
中文摘要
英文摘要
前 言
第一部分 人促甲狀腺激素受體（hTSHR）真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
    材料與方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
第二部分 人促甲狀腺激素受體表達(dá)載體在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)
    材料與方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
全文小結(jié)
附 圖
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
致 謝
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本文編號(hào)：2884374