為了分析驗證phaA、phaB和phaC三個基因的生物學(xué)功能，本實驗采用PCR技術(shù)，從合成PHA的pseudomanas sp．菌株的亞克隆基因組片段中，分離出phaA、phaB和phaC三個基因片段，定向克隆至原核表達(dá)載體pBV220上，構(gòu)建了三個原核生物表達(dá)載體pBV-A、pBV-B和pBV-C，通過對表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)蛋白產(chǎn)物的SDS-PAGE分析、生物活性與功能分析，確定了基因phaA、phaB和phaC的生物學(xué)功能。結(jié)果表明： 1．利用所提取的開放閱讀框架的序列設(shè)計三對引物，采用PCR技術(shù)，從合成PHA的亞克隆片段中分離出phaA、phaB和phaC三個基因片段，經(jīng)凝膠電泳分析表明，所克隆的三個基因分子量大小與推測的三個開放閱讀框架中基因片段大小一致。 2．將phaA、phaB和phaC片段雙酶切后，定向克隆至原核表達(dá)載體pBV220，構(gòu)建了三個原核表達(dá)載體pBV-A、pBV-B和pBV-C；經(jīng)酶切分析表明，所克隆的三個基因phaA、phaB和phaC置于表達(dá)載體的正確閱讀框架下。 3．利用溫度誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后2小時外源基因開始表達(dá)，所表達(dá)蛋白的量隨著時間的增加而增加，當(dāng)誘導(dǎo)時間為4小時后外源基因表達(dá)的增加量趨于平穩(wěn)，確定4小時為較為合適的誘導(dǎo)時間。 4．表達(dá)載體pBV-A、pBV-B和pBV-C經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)所表達(dá)的蛋白均為可溶性蛋白，沒有包涵體出現(xiàn)；蛋白經(jīng)SDS—PAGE分析表明，基因phaA表達(dá)的蛋白分子量為42kDa，與β—酮硫裂解酶分子量大小一致；基因phaB表達(dá)的蛋白分子量為26kDa，與乙酰乙酰CoA還原酶分子量大小一致；基因phaC表達(dá)的蛋白分子量為63kDa，與PHA合成酶分子量大小一致。 5．將phaA、phaB和phaC基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物混和后，加入底物乙酰CoA，于230nm—240nm波長下，對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在波長235nm處有明顯的PHA特異吸收峰；表明混和物中有PHA的產(chǎn)生，所表達(dá)的蛋白具有生物學(xué)活性和特定功能，證實所克隆的phaA、phaB和phaC就是合成PHA所需的三個基因。
【學(xué)位單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：Q785
【部分圖文】：

phaA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果因的PCR產(chǎn)物;M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量PCRamPlifieationofPhaAproduetofPhaA;M:PCRmarker，GC含量為65%，在PCR擴(kuò)增的過提高擴(kuò)增的特異性。PCR擴(kuò)增的循環(huán)的三個步驟為:94℃變性1分鐘，鐘，最后于4℃保溫。擴(kuò)增結(jié)果如析表明，所擴(kuò)增片段的分子量約7B分子量大小一致。

2phaA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果A基因的PCR產(chǎn)物;M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分2PCRamPlifieationofPhaA:PCRproduetofPhaA;M:PCRmarbp，GC含量為65%，在PCR擴(kuò)增數(shù)來提高擴(kuò)增的特異性。PCR擴(kuò)增循環(huán)的三個步驟為:94℃變性110分鐘，最后于4℃保溫。擴(kuò)增泳分析表明，所擴(kuò)增片段的分子phaB分子量大小一致。

.skb，GC含量為66%，AT與GC分，GC同時出現(xiàn)8~IObp以上而沒的變性與復(fù)性過程中所產(chǎn)生二級溫度(62℃)來調(diào)整目的基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的循環(huán)程序為:94℃95℃變性1分鐘，62℃復(fù)性1分鐘溫。擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示:PCR擴(kuò)skb，與所提取的開放閱讀框架中
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本文編號：2884295