發(fā)布時(shí)間：2020-11-06 10:53

　　 與周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system,PNS)的再生和功能恢復(fù)不同,中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷后不能再生。長期以來,研究者們?cè)囉昧硕喾N方法以促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生,如給予神經(jīng)生長因子、去除膠質(zhì)瘢痕、移植干細(xì)胞等。此外,基因治療也是一種廣泛應(yīng)用于促CNS再生的方法,在這一過程中,一些新基因被發(fā)現(xiàn)有著很大的應(yīng)用前景,腎母細(xì)胞瘤過度表達(dá)基因(Nephroblastoma Overexpression gene,nov)就是其中之一。nov是1991年發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因,其所編碼產(chǎn)物(NOV蛋白)是一種胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)結(jié)合蛋白(IGF- binding protein,IGFBPs),屬于IGF家族的成員。有資料表明nov基因與動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和修復(fù)之間存在一定的關(guān)系,可能參與CNS損傷后的再生和修復(fù)過程。近年,神經(jīng)科學(xué)工作者在CNS損傷方面的研究中對(duì)又一種膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生了極大的興趣,這種被稱作嗅球成鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells , OECs)的膠質(zhì)細(xì)胞是介于施萬氏細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞之間的一類細(xì)胞,在中樞和外周神經(jīng)內(nèi)可具有施萬細(xì)胞類似的細(xì)胞內(nèi)成髓鞘功能,在脊髓損傷和神經(jīng)退行性病變中可誘導(dǎo)髓鞘生長。從OECs新功能的發(fā)現(xiàn)至今,它已經(jīng)成為把膠質(zhì)細(xì)胞和CNS再生相聯(lián)系的一個(gè)熱點(diǎn),但是以O(shè)ECs作為受體細(xì)胞攜帶目的基因的研究還少見報(bào)道�；蛐揎椀腛ECs移植治療CNS損傷結(jié)合了OECs和nov的共同優(yōu)點(diǎn),具有研究價(jià)值。 為了確定nov對(duì)OECs增殖分化的影響以及nov基因工程化OECs對(duì)CNS再生和功能修復(fù)的影響,把nov基因促進(jìn)中樞的再生與嗅球成鞘細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷作用結(jié)合起來,尋找一種修復(fù)中樞神經(jīng)損傷的新方法,本文就此進(jìn)行了系列研究.(1) 嗅球成鞘細(xì)胞體外取材培養(yǎng)與體外生長特性,細(xì)胞增殖,活性研究;(2)NOV質(zhì)粒擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染和表達(dá),觀察NOV對(duì)OECs增殖分化的作用;(3)nov基因轉(zhuǎn)染前后OECs的雙向電泳分析,尋找差異點(diǎn),為后期差異蛋白鑒定打基礎(chǔ)。希望轉(zhuǎn)染后OECs恒定表達(dá)NOV,通過OECs和NOV的共同作用,可能為CNS再生修復(fù)提供更適合的微環(huán)境。主要結(jié)果如下: 1、倒置顯微鏡下,接種24小時(shí)后大部分OECs貼壁呈球狀,周圍有云狀物質(zhì)分布,培養(yǎng)3天后的OECs呈梭狀,主要呈雙極,三極,蹼狀的生長錐樣結(jié)構(gòu)明顯,2～14天的細(xì) WP=10 胞純度可達(dá)95%以上,且細(xì)胞純度不隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而明顯下降。 2、純化后培養(yǎng)2天,細(xì)胞主要呈雙極,三極,細(xì)胞走向基本一致,形態(tài)近似Schwann細(xì)胞,8天時(shí)細(xì)胞走向基本一致。 3、OECs免疫細(xì)胞化學(xué)染色及純度檢測(cè):未純化前培養(yǎng)8天,P75免疫反應(yīng)細(xì)胞胞體較突起著色為深,細(xì)胞走向極為不一,純化后培養(yǎng)2天的細(xì)胞幾乎均呈陽性,胞膜著色較深,形態(tài)呈三角或條梭狀,細(xì)胞走向不一,背景干凈。 4、低溫保存過的嗅鞘細(xì)胞復(fù)蘇后生長良好,活性,形態(tài)呈梭形,與凍存前一致�；罴�(xì)胞數(shù)量達(dá)80%以上。 5、對(duì)pcDNA3.1-NOV質(zhì)粒擴(kuò)增,對(duì)獲得的cDNA測(cè)序,證明獲得產(chǎn)物完全符合設(shè)計(jì)要求。在此基礎(chǔ)上成功地將其轉(zhuǎn)染到OECs細(xì)胞,用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和 Western-blot方法檢測(cè)到NOV的表達(dá)。 6、與nov修飾的OECs聯(lián)合培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)有許多DRG細(xì)胞向外遷移,細(xì)胞折光性強(qiáng),突起較長而纖細(xì),并形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。未修飾的OECs組只有少量的細(xì)胞遷移和突起生長,細(xì)胞遷移和突起生長都很局限。空白對(duì)照組DRG僅有細(xì)胞遷移。 7、利用雙向電泳技術(shù)分離轉(zhuǎn)染前后OECs表達(dá)的差異蛋白,為下一步差異蛋白鑒定提供線索。 綜上所述,嗅球成鞘細(xì)胞的生長受不同因素影響,細(xì)胞純度不隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而明顯下降。nov基因修飾嗅球成鞘細(xì)胞表達(dá)差異蛋白,為將來質(zhì)譜鑒定差異蛋白及尋找新的再生因子提供線索。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R329
【部分圖文】：

圖 2-1 pcDNA3.1/Myc-His(+)/LacZ 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖 NOVcDNA 序列檢測(cè):增的 NOVcDNA 序列和方向是否與報(bào)道基因序列一致,采表明,序列與報(bào)道的基因序列、方向完全一致。A 全長序列GTACCACA TGAGCGTCTT CCTGCGAAAG CAATGCCTCT GCCTAGGCTCAAGTCTC TGCAACTCTG CGCTGCCCGT CTCGGTGCCC GAGCCAGTGCCCCCGGG GTCCGCTCGG TGCTAGACGG CTGCTCCTGC TGTCCGGTGTTGCTCTG AGATGAGACC CTGCGACCAG AGCAGCGGTC TCTACTGCGGAGACTGG CATTTGCATG GTTCCAGAGG GAGACAACTG TGTGTTCGAAGAAGTTT GAGCCGAACT GTCAATACCA CTGCACCTGC AGAGATGGGCCAGCTGG ATGTGCTTCT GCCAGGTCCT GACTGCCAG CTCCAAAAATGCGAAAA GTGGACCTGT GGCTCAGAGG AGAAGGGGAC ACTGGGAGG

大鼠OECs培養(yǎng)24小時(shí).相差顯微鏡下X100

大鼠OHCs培養(yǎng)2大，相差顯微鏡hX200
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 李成仁,李巍,蔡文琴,蘇炳銀,陳德英;NOV對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年01期

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本文編號(hào)：2873047