目的原核表達結核分枝桿菌Rv3425-Rv1168c融合蛋白并進行純化,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法評價重組蛋白在結核病血清學診斷中的價值。方法以結核分枝桿菌H37Rv基因組為模板,通過重疊PCR擴增得到Rv3425-Rv1168c全核酸序列克隆至表達載體pET-24b中,轉入大腸桿菌BL21(DE3)進行誘導、表達和純化,通過ELISA檢測100份確診結核病人、20例非結核呼吸疾病患者、100份健康人血清,評價融合蛋白進行臨床血清學診斷的可行性。結果 Rv3425-Rv1168c融合蛋白在原核系統(tǒng)內獲得高表達,純化的融合蛋白經(jīng)ELISA方法測定,在血清學實驗中敏感性為54%,特異性為95%。結論 Rv3425-Rv1168c融合蛋白具有較高的抗原特異性和免疫原性,在結核病血清學診斷方面具有很大的應用價值。
【部分圖文】：

８ｃ核酸全序列，取少量ＰＣＲ產(chǎn)物進行１％瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖１所示，在目的分子量５３０ｂｐ、９７０ｂｐ、１５１８ｂｐ處分別有清晰的Ｒｖ３４２５、Ｒｖ１１６８ｃ以及Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ條帶。雙酶切重疊ＰＣＲ產(chǎn)物，克隆到載體ｐＥＴ－２４ｂ中，轉化至感受態(tài)ＢＬ（ＤＥ３）細胞。Ｍ．ＤＬ２０００；１．Ｒｖ３４２５核酸片段；２．Ｒｖ１１６８ｃ核酸片段；３．Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ核酸片段圖１Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ核酸序列ＰＣＲ凝膠電泳鑒定結果Ｆｉｇ．１ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｆｒａｇ－ｍｅｎｔ２．２Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白原核表達分析將工程菌接種含卡那霉素的ＬＢ培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，經(jīng)ＩＰＴＧ誘導后，低溫條件下對菌體超聲破碎，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳結果顯示（圖２），在目的分子量５５ｋＤ處，Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ獲得較高表達，但主要以包涵體的形式存在，融合蛋白的表達量占細菌總蛋白的３０％左右。２．３Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白包涵體復性與純化Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ包涵體經(jīng)過初步提純，在８ｍｏｌ／Ｌ尿素與ＰＢＳ緩沖液的變性條件下進行親和純化，分別以５０ｍｍｏｌ／Ｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脫雜蛋白和目的融合蛋白，通過ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析發(fā)現(xiàn)（如圖３

－Ｒｖ１１６８ｃ包涵體經(jīng)過初步提純，在８ｍｏｌ／Ｌ尿素與ＰＢＳ緩沖液的變性條件下進行親和純化，分別以５０ｍｍｏｌ／Ｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脫雜蛋白和目的融合蛋白，通過ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析發(fā)現(xiàn)（如圖３所示），純化后的融合蛋白純度可達到９０％以上，對純化的蛋白按１∶１的比例水透析６次后冰Ｍ．低分子量蛋白標準；１．未誘導的全菌體蛋白；２．經(jīng)ＩＰＴＧ誘導的全菌體蛋白；３．超聲上清；４．超聲沉淀圖２ｐＥＴ－２４ｂ－Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ原核表達產(chǎn)物ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄ－ｕｃｔｓｏｆｐＥＴ－２４ｂ－Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ干保存。Ｍ．低分子量蛋白標準；１．上樣前；２．５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脫峰；３．１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脫峰圖３Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白親和純化ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ２．４Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ與ＥＬＩＳＡ分析純化后的Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白經(jīng)ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳后轉移至ＰＶＤＦ膜上，分批次經(jīng)３例強陽性人血清和６例健康人血清孵育、ＨＲＰ標記羊抗人二抗結合反應，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ結果見圖４。結果表

１．未誘導的全菌體蛋白；２．經(jīng)ＩＰＴＧ誘導的全菌體蛋白；３．超聲上清；４．超聲沉淀圖２ｐＥＴ－２４ｂ－Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ原核表達產(chǎn)物ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄ－ｕｃｔｓｏｆｐＥＴ－２４ｂ－Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ干保存。Ｍ．低分子量蛋白標準；１．上樣前；２．５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脫峰；３．１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脫峰圖３Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白親和純化ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ２．４Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ與ＥＬＩＳＡ分析純化后的Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白經(jīng)ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳后轉移至ＰＶＤＦ膜上，分批次經(jīng)３例強陽性人血清和６例健康人血清孵育、ＨＲＰ標記羊抗人二抗結合反應，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ結果見圖４。結果表明，純化后的Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白能與３例確診結核病人血清抗體結合，而與健康人對照血清標本不反應，顯示重組融合蛋白具有較強的抗原性和特異性。圖４Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ與不同人陽性血清ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ結果Ｆｉｇ．４ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｏｆＲｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃｆｕｓｉｏｎ
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本文編號：2872442