目的原核表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Rv3425-Rv1168c融合蛋白并進(jìn)行純化,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法評(píng)價(jià)重組蛋白在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的價(jià)值。方法以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組為模板,通過重疊PCR擴(kuò)增得到Rv3425-Rv1168c全核酸序列克隆至表達(dá)載體pET-24b中,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)、表達(dá)和純化,通過ELISA檢測(cè)100份確診結(jié)核病人、20例非結(jié)核呼吸疾病患者、100份健康人血清,評(píng)價(jià)融合蛋白進(jìn)行臨床血清學(xué)診斷的可行性。結(jié)果 Rv3425-Rv1168c融合蛋白在原核系統(tǒng)內(nèi)獲得高表達(dá),純化的融合蛋白經(jīng)ELISA方法測(cè)定,在血清學(xué)實(shí)驗(yàn)中敏感性為54%,特異性為95%。結(jié)論 Rv3425-Rv1168c融合蛋白具有較高的抗原特異性和免疫原性,在結(jié)核病血清學(xué)診斷方面具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
【部分圖文】：

８ｃ核酸全序列，取少量ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行１％瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖１所示，在目的分子量５３０ｂｐ、９７０ｂｐ、１５１８ｂｐ處分別有清晰的Ｒｖ３４２５、Ｒｖ１１６８ｃ以及Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ條帶。雙酶切重疊ＰＣＲ產(chǎn)物，克隆到載體ｐＥＴ－２４ｂ中，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)ＢＬ（ＤＥ３）細(xì)胞。Ｍ．ＤＬ２０００；１．Ｒｖ３４２５核酸片段；２．Ｒｖ１１６８ｃ核酸片段；３．Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ核酸片段圖１Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ核酸序列ＰＣＲ凝膠電泳鑒定結(jié)果Ｆｉｇ．１ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｆｒａｇ－ｍｅｎｔ２．２Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白原核表達(dá)分析將工程菌接種含卡那霉素的ＬＢ培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)后，低溫條件下對(duì)菌體超聲破碎，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳結(jié)果顯示（圖２），在目的分子量５５ｋＤ處，Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ獲得較高表達(dá)，但主要以包涵體的形式存在，融合蛋白的表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的３０％左右。２．３Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白包涵體復(fù)性與純化Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ包涵體經(jīng)過初步提純，在８ｍｏｌ／Ｌ尿素與ＰＢＳ緩沖液的變性條件下進(jìn)行親和純化，分別以５０ｍｍｏｌ／Ｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脫雜蛋白和目的融合蛋白，通過ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析發(fā)現(xiàn)（如圖３

－Ｒｖ１１６８ｃ包涵體經(jīng)過初步提純，在８ｍｏｌ／Ｌ尿素與ＰＢＳ緩沖液的變性條件下進(jìn)行親和純化，分別以５０ｍｍｏｌ／Ｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脫雜蛋白和目的融合蛋白，通過ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析發(fā)現(xiàn)（如圖３所示），純化后的融合蛋白純度可達(dá)到９０％以上，對(duì)純化的蛋白按１∶１的比例水透析６次后冰Ｍ．低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；１．未誘導(dǎo)的全菌體蛋白；２．經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)的全菌體蛋白；３．超聲上清；４．超聲沉淀圖２ｐＥＴ－２４ｂ－Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ原核表達(dá)產(chǎn)物ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄ－ｕｃｔｓｏｆｐＥＴ－２４ｂ－Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ干保存。Ｍ．低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；１．上樣前；２．５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脫峰；３．１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脫峰圖３Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白親和純化ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ２．４Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ與ＥＬＩＳＡ分析純化后的Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白經(jīng)ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳后轉(zhuǎn)移至ＰＶＤＦ膜上，分批次經(jīng)３例強(qiáng)陽(yáng)性人血清和６例健康人血清孵育、ＨＲＰ標(biāo)記羊抗人二抗結(jié)合反應(yīng)，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ結(jié)果見圖４。結(jié)果表

１．未誘導(dǎo)的全菌體蛋白；２．經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)的全菌體蛋白；３．超聲上清；４．超聲沉淀圖２ｐＥＴ－２４ｂ－Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ原核表達(dá)產(chǎn)物ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄ－ｕｃｔｓｏｆｐＥＴ－２４ｂ－Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ干保存。Ｍ．低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；１．上樣前；２．５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脫峰；３．１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脫峰圖３Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白親和純化ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ２．４Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ與ＥＬＩＳＡ分析純化后的Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白經(jīng)ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳后轉(zhuǎn)移至ＰＶＤＦ膜上，分批次經(jīng)３例強(qiáng)陽(yáng)性人血清和６例健康人血清孵育、ＨＲＰ標(biāo)記羊抗人二抗結(jié)合反應(yīng)，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ結(jié)果見圖４。結(jié)果表明，純化后的Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白能與３例確診結(jié)核病人血清抗體結(jié)合，而與健康人對(duì)照血清標(biāo)本不反應(yīng)，顯示重組融合蛋白具有較強(qiáng)的抗原性和特異性。圖４Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ與不同人陽(yáng)性血清ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ結(jié)果Ｆｉｇ．４ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｏｆＲｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃｆｕｓｉｏｎ
【參考文獻(xiàn)】

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2 曹仕鵬;蔣之;傅滿姣;;脊柱結(jié)核延誤診斷及治療困難原因分析[J];臨床誤診誤治;2015年12期

3 孫衛(wèi)國(guó);張靈霞;熊志紅;楊秉芬;程小星;;結(jié)核分枝桿菌Rv3425蛋白原核可溶性表達(dá)[J];實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2014年12期

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5 余曉麗;孫戰(zhàn)強(qiáng);周晨俊;溫子祿;陳軍;孫慶文;王洪海;張舒林;;結(jié)核分枝桿菌Rv1168c蛋白的基因表達(dá)、純化及結(jié)構(gòu)分析[J];微生物學(xué)報(bào);2010年07期

【共引文獻(xiàn)】

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【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

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4 秦世炳;董偉杰;周新華;陳效友;張海青;宋言崢;唐神結(jié);肖和平;金鋒;馬遠(yuǎn)征;王自立;;正確理解和認(rèn)識(shí)骨與關(guān)節(jié)結(jié)核診療的若干問題[J];中國(guó)防癆雜志;2013年05期

5 肖勇;李長(zhǎng)軍;謝楊;;手術(shù)治療脊柱結(jié)核19例失敗原因探討[J];武警醫(yī)學(xué);2012年10期

6 王雅寧;;熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌臨床應(yīng)用分析[J];實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2012年09期

7 趙武斌;;椎結(jié)核早期治療的臨床分析[J];中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥;2012年19期

8 陳建波;黃同花;陳郁筠;吳馳;肖顏玉;羅凱;葉飛娣;;結(jié)核病3種實(shí)驗(yàn)診斷方法比較與分枝桿菌耐藥性分析[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2012年04期

9 孫集思;陳亦洋;;PCR法檢測(cè)痰液結(jié)核桿菌對(duì)診斷價(jià)值的研究[J];中國(guó)社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學(xué)專業(yè));2012年02期

10 吳靜希;岳俊杰;姜永強(qiáng);郝淮杰;李艷;;結(jié)核分枝桿菌Rv3425特異性蛋白片段與CFP10-ESAT6融合蛋白在結(jié)核抗體檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值[J];生物技術(shù)通訊;2011年03期

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5 張舒林,高三友,張進(jìn)忠,王國(guó)斌;外周血單個(gè)核細(xì)胞中結(jié)核分枝桿菌DNA的檢測(cè)[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1999年06期

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7 羅振華;王和;;結(jié)核分枝桿菌穩(wěn)定L型感染檢測(cè)方法的研究[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2009年01期

8 馮經(jīng)華;尹鳳鳴;嚴(yán)振球;;目前結(jié)核分枝桿菌感染中重要免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子作用的研究進(jìn)展[J];臨床軍醫(yī)雜志;2007年02期

9 劉海燦;萬(wàn)康林;;結(jié)核分枝桿菌基因組單核苷酸多態(tài)性研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2011年04期

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本文編號(hào)：2872442