本文關(guān)鍵詞：甲型副傷寒沙門氏菌噬菌體LSPA1生物學(xué)特性及其與宿主相互作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甲型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi A)是導(dǎo)致甲型副傷寒的致病菌,經(jīng)糞口途徑傳播；噬菌體是一種細(xì)菌病毒,能夠侵染并裂解宿主菌。噬菌體普遍存在于宿主菌中,所以在大多數(shù)環(huán)境下,噬菌體和宿主菌參與持續(xù)的聯(lián)合進(jìn)化,兩者在自然界達(dá)到宿主一噬菌體動(dòng)態(tài)平衡。目前對(duì)噬菌體與宿主之間相互作用機(jī)制尚不清晰,本文篩選了一株甲型副傷寒沙門氏菌烈性噬菌體(LSPA1)、對(duì)其生物學(xué)特性和基因組學(xué)進(jìn)行分析并研究噬菌體與甲型副傷寒沙門氏菌相互作用,進(jìn)而更深入認(rèn)識(shí)噬菌體、深層次了解噬菌體與宿主之間的相互作用。目前對(duì)于治療病原菌的感染主要是利用抗生素,然而抗生素的濫用以及生物膜的形成大大降低了抗生素治療的效果,因此研究一種新型的治療方法尤為重要。由于噬菌體的宿主特異性和強(qiáng)感染性,對(duì)宿主菌而言是個(gè)致命的威脅,因此科研工作者設(shè)想通過噬菌體治療達(dá)到治愈病原菌感染的效果。為了獲得一株新型的噬菌體并深入研究,作者將醫(yī)院污水和甲型副傷寒沙門氏菌混合培養(yǎng)后,分離純化甲型副傷寒沙門氏菌噬菌體；并研究LAPS1部分生物學(xué)特性,包括最佳感染復(fù)數(shù)、pH和溫度敏感性、結(jié)構(gòu)蛋白以及初步受體分析。提取LSPA1基因組,用鳥槍法測(cè)全基因序列,分析其進(jìn)化樹、同源性和開放閱讀框。在研究噬菌體與宿主相互作用中,先利用結(jié)合轉(zhuǎn)座篩選抗噬菌體的甲型副傷寒沙門氏菌突變菌,鑒定插入基因,并通過同源重組定點(diǎn)突變和互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明,由于該種基因的突變引起甲型副傷寒沙門氏菌突變菌抗噬菌體的特性；另外發(fā)現(xiàn)σ-54依賴的翻譯調(diào)節(jié)器基因與生物膜形成有關(guān)聯(lián)。噬菌體篩選結(jié)果表明：1)將醫(yī)院污水和甲型副傷寒沙門氏菌混合培養(yǎng),取菌液離心,用上清做雙層平板,有透明的噬斑出現(xiàn),說明了在醫(yī)院污水中成功篩選出甲型副傷寒沙門氏菌裂解性噬菌體,命名為LSPA1。2)將篩選的噬菌體LSPA1進(jìn)行濃縮后,電鏡觀察,噬菌體LSPA1形態(tài)呈現(xiàn)64面體的頭部,并屬于長尾噬菌體。3)提取噬菌體基因組用限制性內(nèi)切酶酶切,結(jié)果表明基因組能酶切,證明噬菌體LSPA1基因組屬于雙鏈DNA。噬菌體LSPA1生物特性分析：1)選擇不同MOI接種噬菌體,結(jié)果表明在MOI為0.2時(shí),能獲得最高滴度的噬菌體,證明了0.2為噬菌體LSPA1最佳MOI。2)噬菌體LSPA1一步生長曲線中潛伏期為20 min,爆發(fā)期為50 mm,爆發(fā)量為129。3)將噬菌體LSPA1進(jìn)行不同溫度和pH處理后,再測(cè)量其滴度,噬菌體LSPA1在pH值3～10之間,具有較高的滴度,pH值在1～2和11～12之間,喪失活性；并且隨溫度上升滴度明顯降低,在80℃幾乎無活性副甲噬菌體存在。4)噬菌體LSPA 1進(jìn)行SDS-PAGE分析,主要包含相對(duì)分子質(zhì)量約67KD、60KD、55KD、40KD四種蛋白,其中55KD為衣殼蛋白。5)實(shí)驗(yàn)中初步分析噬菌體的受體為脂多糖和外膜蛋白。噬菌體LSPA1基因組學(xué)分析：1)噬菌體LSPA1基因組全長為41880bp,堿基組成：A=25.09%,T=24.43%,G=25.13%,C=25.35%,G+C=50.48%。2)噬菌體LSPA1全基因含有58個(gè)ORF,其中38個(gè)在正鏈上,20個(gè)在負(fù)鏈上。3)噬菌體LSPA1不僅僅和沙門氏菌噬菌體具有高度親緣性,同樣和大腸桿菌噬菌體也具有很高的親緣性,其中與SETP3基因組具有高度相似性。4)將噬菌體LSPA1全基因序列提交GenBank,登錄號(hào)為KM272358.噬菌體LSPA1感染宿主相關(guān)基因：1)篩選6株抗噬菌體突變菌,通過測(cè)序得知突變基因分別是溶菌酶、假設(shè)的蛋白質(zhì)(可能甲基轉(zhuǎn)移酶)、硫代硫酸鹽還原酶電子前體、假定傳感器激酶蛋白、乙酰乳酸合酶同工酶III大亞基、假定σ-54依賴的翻譯調(diào)節(jié)器。2)研究發(fā)現(xiàn)假定a-54依賴的翻譯調(diào)節(jié)器突變菌生物膜的形態(tài)明顯發(fā)生改變以及成膜能力顯著增強(qiáng)。3)通過定點(diǎn)突變和互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明假定a-54依賴的翻譯調(diào)節(jié)器是抗噬菌體和生物膜相關(guān)基因,且a-54依賴的翻譯調(diào)節(jié)器的缺失宿主表現(xiàn)出抗噬菌體、成膜能力顯著增強(qiáng)的特性。本研究中,從醫(yī)院的污水中篩選一株裂解性甲型副傷寒沙門氏菌噬菌體,并分析其生物學(xué)特性,證明了噬菌體LSPA1屬于雙鏈、長尾噬菌體；對(duì)噬菌體LSPA1基因基因組學(xué)和宿主甲型副傷寒沙門氏菌相互作用分析,證明了其中6種基因與噬菌體LSPA1侵染相關(guān),并且σ-54依賴的翻譯調(diào)節(jié)器的缺失會(huì)顯著增強(qiáng)甲型副傷寒沙門氏菌的成膜能力。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)研究噬菌體侵染機(jī)制和利用噬菌體治療病原菌感染奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：甲型副傷寒沙門氏菌 篩選與分離 基因組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 縮略語索引10-11
• 摘要11-13
• ABSTRACT13-16
• 第一章 緒論16-19
• 1.1 噬菌體治療相關(guān)研究16-17
• 1.2 生物膜研究現(xiàn)狀17
• 1.3 本文研究背景及其思路17-18
• 1.4 本文研究的目的及意義18-19
• 第二章 甲型副傷寒沙門氏菌噬菌體LSPA1的分離與鑒定19-29
• 2.1 材料與方法19-25
• 2.1.1 材料19-21
• 2.1.2 方法21-25
• 2.2 結(jié)果25-26
• 2.2.1 甲型副傷寒沙門氏菌噬菌體LSPA1的分離25
• 2.2.2 噬菌體LSPA1電鏡觀察25-26
• 2.2.3 噬菌體LSPA1核酸酶切分析26
• 2.3 討論26-28
• 2.3.1 噬菌體溫和性和裂解性26-27
• 2.3.2 噬菌體的分離27
• 2.3.3 噬菌體生物學(xué)特性分析27
• 2.3.4 噬菌體高速密度梯度離心27-28
• 2.3.5 噬菌體形態(tài)分類28
• 2.4 小結(jié)28-29
• 第三章 噬菌體LSPA1的生物學(xué)特征29-43
• 3.1 材料與方法29-36
• 3.1.1 材料29-32
• 3.1.2 方法32-36
• 3.2 結(jié)果36-39
• 3.2.1 最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定36
• 3.2.2 繪制噬菌體LSPA1一步生長曲線36-37
• 3.2.3 甲型副傷寒沙門氏菌抗噬菌體自然突變率的檢測(cè)37
• 3.2.4 噬菌體LSPA1 pH及溫度敏感性檢測(cè)37-38
• 3.2.5 噬菌體LSPA1結(jié)構(gòu)蛋白分析38-39
• 3.2.6 噬菌體LSPA1受體初步分析39
• 3.3 討論39-41
• 3.3.1 噬菌體感染復(fù)數(shù)40
• 3.3.2 噬菌體一步生長曲線40
• 3.3.3 噬菌體核心蛋白分析40
• 3.3.4 噬菌體自然突變40-41
• 3.3.5 噬菌體侵染41
• 3.3.6 噬菌體特性分析41
• 3.4 小結(jié)41-43
• 第四章 噬菌體LSPA1基因組學(xué)解析43-60
• 4.1 材料與方法43-50
• 4.1.1 材料43-45
• 4.1.2 方法45-50
• 4.2 結(jié)果50-57
• 4.2.1 噬菌體LSPA1基因組堿組成分析50
• 4.2.2 開放閱讀框的分析和編碼序列的分析50
• 4.2.3 推定基因編碼產(chǎn)物多重序列比對(duì)分析50-53
• 4.2.4 tRNA編碼序列分析53
• 4.2.5 噬菌體LSPA1基因組注釋后GenBank提交53-54
• 4.2.6 噬菌體LSPA1相似噬菌體的比較54
• 4.2.7 基因編碼產(chǎn)物多重序列比對(duì)分析和系統(tǒng)發(fā)生樹的繪制54-56
• 4.2.8 CoreGene基因組序列分析56-57
• 4.3 討論57-59
• 4.3.1 鳥槍法測(cè)序57
• 4.3.2 生物信息學(xué)57-58
• 4.3.3 噬菌體基因組學(xué)與基因組注釋58
• 4.3.4 噬菌體同源性分析58-59
• 4.4 小結(jié)59-60
• 第五章 噬菌體LSPA1感染宿主相關(guān)基因60-80
• 5.1 材料與方法60-70
• 5.1.1 材料60-63
• 5.1.2 方法63-70
• 5.2 結(jié)果70-76
• 5.2.1 野生型甲型副傷寒沙門氏菌Rif~+抗性的誘導(dǎo)70-71
• 5.2.2 抗噬菌體突變菌篩選71
• 5.2.3 突變菌成膜的觀察71-73
• 5.2.4 突變位點(diǎn)的鑒定73
• 5.2.5 定點(diǎn)突變并驗(yàn)證73-75
• 5.2.6 突變菌互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)75
• 5.2.7 突變菌菌體蛋白表達(dá)鑒定75-76
• 5.3 討論76-78
• 5.3.1 pSC189結(jié)合轉(zhuǎn)座76-77
• 5.3.2 轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)鑒定77
• 5.3.3 抗噬菌體和生物膜突變菌分析77-78
• 5.3.4 突變菌互補(bǔ)分析78
• 5.4 小結(jié)78-80
• 全文總結(jié)80-82
• 展望82-84
• 致謝84-85
• 參考文獻(xiàn)85-90
• 附錄A 攻讀碩士期間發(fā)表論文目錄90

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：甲型副傷寒沙門氏菌噬菌體LSPA1生物學(xué)特性及其與宿主相互作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：287156