瘧疾仍然是一種嚴(yán)重危害人類健康的寄生蟲病。由于抗藥蟲株以及媒介按蚊耐藥性的不斷發(fā)生和蔓延，世界瘧疾形勢(shì)日趨惡化，防制難度不斷加大。因此，研制高效瘧疾疫苗是控制和消滅瘧疾的重要途徑。雖然瘧疾疫苗的研究進(jìn)展迅速，已由傳統(tǒng)的死疫苗和減毒疫苗發(fā)展到基因工程疫苗，亞單位疫苗。但迄今為止沒有哪一種疫苗能真正有效地控制瘧疾的流行與傳播。研制多種抗原構(gòu)成的復(fù)合疫苗(又稱“雞尾酒”)疫苗和新型疫苗佐劑是未來瘧疾疫苗發(fā)展的新策略。 為了進(jìn)一步提高瘧疾疫苗的免疫原性和保護(hù)性，本研究將惡性瘧原蟲保護(hù)性抗原復(fù)合基因PfCMR與人白細(xì)胞介素-2(IL-2)基因在體外重組與高效表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了生物學(xué)和免疫學(xué)活性鑒定。 用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶酶切質(zhì)粒pWR450-1／PfCMR，回收255bp目的基因片段PfCMR；用EcoRI消化質(zhì)粒pBV220／IL-2，并去磷酸化。再將兩者按10：1摩爾數(shù)混合在連接反應(yīng)體系中連接。重組克隆用氨芐青霉素初篩，PCR擴(kuò)增復(fù)篩。陽(yáng)性克隆子再用內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果得到正向插入的重組質(zhì)粒pBV220／PfCMR-IL-2a，PfCMR基因與IL-2基因重組克隆獲得成功，為惡性瘧原蟲復(fù)合抗原與IL-2的同時(shí)表達(dá)創(chuàng)造條件。 將重組質(zhì)粒pBV220／PfCMR-IL-2α轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，工程菌經(jīng)30℃搖菌，42℃熱誘導(dǎo)高效表達(dá)，用7M鹽酸胍破菌，飽和硫酸銨沉淀、分離表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)SDS-PAGE分析證實(shí)其分子量為25kDa與理論值相符合，表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的37％。表達(dá)蛋白的IL-2活性高達(dá)5×10~5U／L。
【學(xué)位單位】：中山醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：1996
【中圖分類】：R383
【文章目錄】：
Acknowledgement
Abstract （English）
Abstract （Chinese）
List of Figures/Table/Appendices
Glossary of abbreviations
CHAPTER 1: INTRODUCTION
CHAPTER 2: MATERIAL AND METHODS
    EXPERIMENT NO.1 RECOVERY OF TARGET DNA （PfCMR） FROM PLASMID PWR 450-1/PfCMR
        a. Plasmid PWR450-1 PfCMR DNA extraction. Plasmid isolation:
            Preparation of plasmid DNA
        b. Restriction endonuclease digestion of plasmid DNA（PWR450-1）
        c. Isolation and purification
    EXPERIMENT NO. 2 EXTRACTION OF PLASMID pBV220/IL-2 DNA
        a. DNA extraction
        b. Endonuclease digestion （EcoR1）
    EXPERIMENT NO. 3 LIGATION
        a. Dephosphorylation of linearized plasmid DNA
        b. Ligation of cohesive termini
        c. Ligation of blunt-ended DNA
    EXPERIMENT NO. 4 TRANSFORMATION
        Preparation of competent Escherichia coli cells
        Transformation reaction
    EXPERIMENT NO. 5 CLONING
        a. Screening of bacterial colonies （by PCR）
        b.Analysis and identification of recombinants by restriction endonuclease digestion
    EXPERIMENT NO. 6 EXPRESSION OF pBV220/PfCMR-IL-2/DH5a
    EXPERIMENT NO. 7 ANALYSIS OF THE EXPRESSED PRODUCTS
        Staining SDS-Polyacrylamide gels with coomassie brilliant blue R250
        Drying SDS-polyacrylamide gels
    EXPERIMENT NO.8 STUDY OF THE BIOLOGICAL AND IMMUNOLOGICAL ACTIVITY OF THE PURIFIED PRODUCTS
        a. Detection of IL-2 by cytotoxic T lymphocyte line （CTLL/MTT）
        b. Humoral immune response
            1. Western blot
                Ⅰ. Transfer of proteins from SDS polyacrylamide gels to solid support
                Ⅱ. Blocking binding sites for immunoglobulins on the nitrocellulose filter
                Ⅲ.Binding of the primary antibody to the target protein
            2. Dot-ELISA
                c. Cellular immune response
CHAPTER.3: RESULTS
    1. Isolation of plasmid DNA
    2. Recovery of target DNA （PfCMR） fragment
    3. Construction of the recombinant vector pBV220/PfCMR-IL-2
        （1） Ligation and transformation
        （2） Transformation
        （3） Screening recombinants by PCR
    4. Identification of positive recombinants by restriction endonuclease digestion
    5. High level expression of pBV220/PfCMR-IL-2
    6. Identification of the expressed protein
        （1） Analysis by Western Blot
        （2） Dot-ELISA Assay
        （3） CTLL/MTT
        （4） T lymphocyte transformation test
FIGURES
CHAPTER 4: DISCUSSION
CHAPTER 5: SUMMARY（English）
SUMMARY（Chinese）
REFERENCES
CHAPTER 6: LITERATURE REVIEW Progress in the development of malaria vaccine
REFERENCES
APPENDICES

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