目的探究體外傳代培養(yǎng)對(duì)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)衰老的影響。方法全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs,待細(xì)胞匯合率達(dá)80%～90%時(shí),進(jìn)行消化傳代及純化培養(yǎng)。對(duì)不同代數(shù)細(xì)胞,進(jìn)行倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生長(zhǎng)特性,繪制1～7 d生長(zhǎng)曲線,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物(CD29、CD45和CD90)和細(xì)胞周期,β-半乳糖苷酶染色并記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),Western印跡法檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白P53和P21表達(dá)情況。結(jié)果 SD大鼠BMSCs的CD29、CD90高表達(dá)(95%),CD45低表達(dá)(5%),細(xì)胞周期中G0/G1期占87.37%;相較于P1～5代細(xì)胞,P7～9代細(xì)胞增殖能力明顯下降,β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多;隨著傳代次數(shù)的增加,BMSCs的P53、P21表達(dá)增高。結(jié)論體外培養(yǎng)傳代次數(shù)的增加可導(dǎo)致SD大鼠BMSCs衰老。
【部分圖文】：

.2BMSCs細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3BM-SCs細(xì)胞周期，細(xì)胞100%為二倍體，其中G0/G1期87.37%，G2/M期4.06%，S期8.57%，提示絕大部分細(xì)胞處于靜止休眠期，符合干細(xì)胞周期特征。2.3不同代數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況分別對(duì)P1、P3、P5、P7和P9代細(xì)胞進(jìn)行1～7d連續(xù)培養(yǎng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，傳代后1～2d處于潛伏期，細(xì)胞增長(zhǎng)不明顯，3～5d進(jìn)入指數(shù)増長(zhǎng)期，6d后細(xì)胞增殖速度便有所減緩，進(jìn)入平臺(tái)期，增殖基本停滯，生長(zhǎng)曲線見圖1。從結(jié)果可發(fā)現(xiàn)P3～P5代的細(xì)胞增殖狀況更良好。圖1CCK-8檢測(cè)不同代數(shù)BMSCs1～7d的增殖能力2.4不同代數(shù)細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率對(duì)不同代數(shù)的細(xì)胞行β-半乳糖苷酶染色，紅色箭頭標(biāo)注的著深藍(lán)色的細(xì)胞即為衰老細(xì)胞(圖2)。隨之進(jìn)行β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，其中P7(52.67%±7.93%)和P9(83.67%±3.27%)相較于P1(3.67%±1.25%)、P3(8.33%±3.11%)和P5(20.00%±5.35%)，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增高(圖2)。2.5不同代數(shù)細(xì)胞P53和P21表達(dá)變化隨著傳代次數(shù)的增加，衰老相關(guān)蛋白P53和P21的蛋白水平表達(dá)量也逐漸增高，Western印跡結(jié)果示:P53和P21在P9代的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為3.43±0.66和3.31±0.28，明顯高于P1代，見圖3，表1。圖2倒置相差顯微鏡下觀察β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞(×100)圖3細(xì)胞傳代對(duì)衰老相關(guān)蛋白P53和P21表達(dá)的影響表1不同代數(shù)細(xì)胞P53和P21表達(dá)水平(x±s，n=3)組別P53蛋白P21蛋白P11．00±0.001．00±0.00P31．60±0．111．15±0．07P52．41±0．361．

細(xì)上赴?芷諤卣?。2.3不同代數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況分別對(duì)P1、P3、P5、P7和P9代細(xì)胞進(jìn)行1～7d連續(xù)培養(yǎng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，傳代后1～2d處于潛伏期，細(xì)胞增長(zhǎng)不明顯，3～5d進(jìn)入指數(shù)増長(zhǎng)期，6d后細(xì)胞增殖速度便有所減緩，進(jìn)入平臺(tái)期，增殖基本停滯，生長(zhǎng)曲線見圖1。從結(jié)果可發(fā)現(xiàn)P3～P5代的細(xì)胞增殖狀況更良好。圖1CCK-8檢測(cè)不同代數(shù)BMSCs1～7d的增殖能力2.4不同代數(shù)細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率對(duì)不同代數(shù)的細(xì)胞行β-半乳糖苷酶染色，紅色箭頭標(biāo)注的著深藍(lán)色的細(xì)胞即為衰老細(xì)胞(圖2)。隨之進(jìn)行β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，其中P7(52.67%±7.93%)和P9(83.67%±3.27%)相較于P1(3.67%±1.25%)、P3(8.33%±3.11%)和P5(20.00%±5.35%)，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增高(圖2)。2.5不同代數(shù)細(xì)胞P53和P21表達(dá)變化隨著傳代次數(shù)的增加，衰老相關(guān)蛋白P53和P21的蛋白水平表達(dá)量也逐漸增高，Western印跡結(jié)果示:P53和P21在P9代的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為3.43±0.66和3.31±0.28，明顯高于P1代，見圖3，表1。圖2倒置相差顯微鏡下觀察β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞(×100)圖3細(xì)胞傳代對(duì)衰老相關(guān)蛋白P53和P21表達(dá)的影響表1不同代數(shù)細(xì)胞P53和P21表達(dá)水平(x±s，n=3)組別P53蛋白P21蛋白P11．00±0.001．00±0.00P31．60±0．111．15±0．07P52．41±0．361．81±0．18P72．86±0．902．79±0．04P93．43±0．661)3．31±0．281)與P1代比較:1)P＜0．053討論BMSCs是骨髓基質(zhì)中的非造血系成體干細(xì)胞，具有多向分化潛
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