丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)基因組編碼兩個包膜(Envelope，E)糖蛋白：E1和E2。E1和E2都是高度N-糖基化的糖蛋白。病毒糖蛋白上的糖鏈?zhǔn)菣C體細(xì)胞識別、結(jié)合的靶分子，并且具有對糖蛋白結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)的特性。病毒的糖鏈還具有保護、穩(wěn)定病毒結(jié)構(gòu)的完整性以及形成屏障以抵御外物的侵入的功能。N-糖基化有很多作用，如影響免疫分子的折疊、成熟、包裝、投送、定位以及穩(wěn)定，影響T細(xì)胞的功能，影響體液免疫的功能，對體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答強弱的調(diào)節(jié)等，然而，N-糖基化作用對HCV感染機體的影響卻知之甚少。為了研究HCV E2糖基化是否會影響病毒蛋白的合成、裝配，以及它對機體免疫應(yīng)答的作用，本文利用定點突變的PCR技術(shù)構(gòu)建E2的三個重要的糖基化位點的突變體，N177NT，N193ST，N177NT／N193ST，采用高保真性的pfx DNA polymerase進行定點突變，使AAC編碼的天冬酰氨(-Asn-)突變?yōu)門AC編碼的酪氨酸(-Tyr-)，使得N-糖基化位點-NNT-，-NST-突變?yōu)?YNT-，-YST-。 我們用野生型E2以及糖基化位點突變型E2的DNA作為DNA疫苗來進行進一步研究，由于DNA疫苗研究中共同存在的一個問題是免疫持續(xù)時間有限，為了維持理想的免疫效果，需要重復(fù)注射DNA或者輔以佐劑。本研究使用丙型肝炎包膜糖蛋白E2的野生型以及不同的糖基化位點突變體E2的DNA(100μg／100μl／只)對BalB／C小鼠進行DNA免疫注射，并設(shè)立生理鹽水空白對照組，以及空載體pcDNA3.1(-)陰性對照組，單獨或聯(lián)合注射佐劑IL-2。注射部位為小鼠雙側(cè)后腿股四頭肌內(nèi)側(cè)，總共免疫三次，每次間隔十天，根據(jù)已有的文獻報道，HCV包膜糖蛋白E2對小鼠的免疫是在初次免疫后50天左右進入抗體產(chǎn)生的高峰，所以，本實驗在末次免疫之后的四周，取小鼠眼球靜脈血，用間接ELISA方法檢測免疫實驗動物體內(nèi)特異性抗體產(chǎn)生情況以及產(chǎn)生抗體的滴度水平；收集的靜脈血經(jīng)過肝素抗凝之后，用流式細(xì)胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)檢測免疫小鼠外周血中CD4~+，CD8~+T淋巴細(xì)胞的變化；無菌取小鼠脾臟，并于37℃，5％CO_2培養(yǎng)，收集經(jīng)過ConA(10mg／ml)誘導(dǎo)的脾細(xì)胞培養(yǎng)72小時的上清液，分別用小鼠IFN-γ和IL-4檢測試劑盒測定上清中IFN-γ和IL-4的分泌水平并進 行比較;為了初步探索EZ的糖基化與分子伴侶之間的相互關(guān)系，分別將野生型 和不同的突變型EZ和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶鈣聯(lián)蛋日(calnexin，CNX)的重組DNA 共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞Hela，用激光顯微共聚焦(eo響eal laser mieroseopy)來觀察它們 在細(xì)胞內(nèi)的定位。 研究結(jié)果顯示，我們成功構(gòu)建兩個單位點突變體以及一個雙位點突變體;并 將野生型EZ連接到原核表達載體pGEX一KG上，并且將野生型/突變型 EZ連接 到真核表達載體peDNA3 .l(一)側(cè)yc一HisB上;免疫小鼠的實驗結(jié)果表明，野生型 以及糖基化位點突變型EZ能夠誘導(dǎo)特異性的體液免疫，產(chǎn)生特異性的抗體，抗 體滴度水平不一致，從1:100一1:800，其中N193ST(EZ一MZ)在免疫應(yīng)答方 面相對于野生型及其他的突變體不僅僅是引起血清轉(zhuǎn)陽率的降低，而且IgG抗體 水平也顯著下降;發(fā)現(xiàn)了突變型及野生型EZ都能引起小鼠CD4+T細(xì)胞數(shù)量的增 加，但是EZ一MZ所引起的CD4+T細(xì)胞數(shù)量的增加也低于其他的組別，各組之間 對CDS+T細(xì)胞數(shù)量的影響并無顯著差異;并對脾細(xì)胞分泌上清中細(xì)胞因子的水 平進行比較，發(fā)現(xiàn)DNA免疫組能刺激IFN一Y的分泌，水平較對照組別高，差異 有顯著性，EZ一MZ引起的改變也略微低于其他實驗組，而IL一4的分泌水平的結(jié) 果顯示各組別之間沒有明顯差異，這初步顯示，DNA疫苗誘導(dǎo)Thl型占優(yōu)勢的 細(xì)胞免疫應(yīng)答;將野生型以及突變型EZ與CNX共同轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的結(jié)果顯示， E2和CNX在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中能夠共表達和共定位，提示了兩者之間的相互作用。 本研究結(jié)果首次揭示了HCV包膜糖蛋白EZ的糖基化在機體對病毒的免疫 應(yīng)答中起到非常重要的作用，尤其是EZ抗原中的N193ST糖基化位點是B細(xì)胞 和CD4+T細(xì)胞識別的重要的糖特異性抗原表位，此糖基化位點的糖鏈可能通過 影響EZ的空間構(gòu)型從而對EZ的體液免疫和細(xì)胞免疫產(chǎn)生影響:僅改變一個位 點就未能或僅能引起較低的抗體水平、僅能刺激CD4+T數(shù)量的輕微增加、對 I剛令的影響也低于其他實驗組;本研究同時也表明，蛋白糖基化與免疫系統(tǒng)有 著密切的關(guān)系，為病毒感染引起免疫應(yīng)答改變的分子機制提供了非常重要的線 索，為進一步闡明HCV包膜糖蛋白的功能以及HCV新型疫苗的研究奠定了基 石出。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖2.點特異性突變序列分析結(jié)果比較Fig.2.Sequeneealignmentofsite一sPeeifiemutantsDSI:PUC19一EZS;CDSZ:PUC19一EZSMl(A529T);CDS3:PUC19一EZSMZ(A577T);ns4:puelg一EZsM3(As29z577T)，圖中顯示不同的單位點突變以及雙位點突變、HCVEZ糖蛋白3個突變體的構(gòu)建將上述三個陽性克隆的插入部分EZs用Sall消化，所得的三個片斷回插入CR2.1一EZS’，并進行方向鑒定。鑒定時，使用的是PcR的方法，常規(guī)操作，引如實驗方法中所述，方向正確的克隆可以看到大小約為400bP的PcR產(chǎn)物(見3)，pCRZ.l一EZMl(A529勸，pCRZ.l一EZMZ(A577T)，pCRZ.l一EZM3(A529T，577勸(3，4，5泳道)，陰性對照(無酶，泳道2)。反之，如果插入的方向正確，則400bp處無陽性的PCR產(chǎn)物條帶出現(xiàn)。

圖3.pCR2.1一EZMI，EZMZ，EZ一M3的方向鑒定ntifieationofdireetionsofPCR2.1一EZMI，EZMZ，EMarker:DL2000:LaneZ:negativecontrol:Lane.1一EZMZ;Lanes:PCR2.1一EZM3型及突變型的真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建eoRV對pCR2.1一EZWT，pCR2.1一EZMI，酶切，并將所得到EZWT，EZMI，EZMZ，E體peDNA3.1。)艦yc一HisB任幾月dlll、EcoRV最終可以在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達，所得到的取不同克隆的質(zhì)粒DNA，所得到的質(zhì)粒DN見圖4)，結(jié)果完全正確，所得到的His一B一EZ印EZ一WT)，peDNA3.1(一)佩ye一His一B一蘭衛(wèi)些輿早印E2一M2)，peDNA3.l(一擔(dān)yc一HIS一B

叮引K乙丁戶尸尸護尸護洲洲的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及不同組別質(zhì)粒DNA對免疫小鼠IFN一Y分泌水平的4standardeurveandeffeetsofwildtyPeandmutantsofofIL-4fromsPlenoeytesof恤mun議edmiee·核表達產(chǎn)物的WesternBlof轉(zhuǎn)染的野生型和不同突變型EZ的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞裂Bfot分析，細(xì)胞按照標(biāo)準(zhǔn)程序處理，抗EZ的第一抗體室溫稀釋，AP一羊抗小鼠的二抗室溫下用TBST按照1:2500稀PEZ一MZ，PEZ一M3分子量大小分別為68kD，66kD，64k
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張東偉,梁布鋒,祁自柏,凌世淦;HCVE2區(qū)基因的分子克隆及序列分析[J];中國病毒學(xué);2001年01期

本文編號：2865566