【【背景】類鼻疽桿菌是一種能夠引起人類疾病甚至死亡的胞內(nèi)寄生菌,Ⅲ型分泌系統(tǒng)在該菌入侵上皮細胞、逃避宿主免疫以及毒力因子的分泌過程中發(fā)揮重要作用,其中bopA基因為TTSS-3基因編碼的重要效應蛋白,在類鼻疽桿菌的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用�！灸康摹繕�(gòu)建類鼻疽桿菌bopA基因敲除菌株,并對其生物學特征進行初步研究�！痉椒ā繕�(gòu)建pK18mobSacB-ΔbopA自殺質(zhì)粒,通過大腸桿菌S17-1λpair以接合的方式轉(zhuǎn)入類鼻疽桿菌,利用同源重組敲除了bopA基因,并用蔗糖平板篩選出菌株,最后在細胞和動物水平檢測敲除菌株的表型變化�！窘Y(jié)果】構(gòu)建了bopA敲除的類鼻疽菌株,并通過細胞和動物實驗證實敲除bopA基因后,細菌的細胞侵襲和胞內(nèi)存活以及體內(nèi)定殖能力都顯著降低�！窘Y(jié)論】利用同源重組成功構(gòu)建類鼻疽bopA基因敲除株,為深入研究該基因的作用靶點奠定了實驗基礎(chǔ)。
【部分圖文】：

trol.2.3敲除菌株與野生株生長曲線以實驗室野毒株BPC006為對照，可見BPC006與BP(ΔbopA)菌株生長情況相似，均在12h達到對數(shù)生長期，而24h后進入生長平臺期(圖5)。說明bopA基因敲除不影響B(tài)P細菌本身的生長活力。2.4bopA基因缺失對類鼻疽桿菌的細胞黏附率和侵襲率的影響作為類鼻疽桿菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的重要分子，bopA基因在細菌致病過程中發(fā)揮著重要作用。為了驗證bopA基因敲除對細菌活力的影響，利用小鼠巨噬細胞RAW264.7進行了細菌的黏附和侵圖5bopA敲除菌與野生菌的生長曲線Figure5GrowthcurvesofbopAknockoutstrainandwild-typestrain

74.45%和0.12%。結(jié)果表明敲除bopA基因后，BP細菌黏附性增加，而進入細胞的能力明顯降低。2.5bopA基因缺失對類鼻疽桿菌胞內(nèi)存活的影響類鼻疽桿菌可以侵入多種吞噬和非吞噬細胞，并在細胞內(nèi)進行增殖，發(fā)揮其細胞毒性，其在胞內(nèi)的存活情況與其抵抗細胞清除能力密切相關(guān)。通過胞內(nèi)存活實驗結(jié)果(圖6)可以看出bopA缺失株侵襲率明顯低于WT(結(jié)果同上)，感染初期細菌存活量減少，可能是感染早期激活了細胞自噬，4h后BPC006野生株在胞內(nèi)快速增殖，而敲除株在胞內(nèi)圖6bopA敲除菌與野生菌胞內(nèi)存活和增殖情況Figure6IntracellularsurvivalandproliferationofbopAknockoutstrainandwild-typestrain增殖緩慢甚至無法增殖，說明bopA基因在類鼻疽桿菌的免疫逃逸中具有重要的作用。2.6bopA基因缺失對類鼻疽桿菌感染后細胞形態(tài)影響類鼻疽桿菌主要是通過抑制LC3介導的吞噬作用，從吞噬體逃逸到細胞胞質(zhì)，一旦細菌進入胞質(zhì)，就會激活BimA介導的肌動蛋白運動活性、大量繁殖并侵入鄰近細胞形成肌動蛋白尾和多核巨細胞(Multinucleargiantcell，MNGC)。由實驗結(jié)果(圖7)可以看出野生株感染4h后細胞形成肌動蛋白尾，而感染8h后大量細菌從細胞中逃逸出來，導致細胞肌動蛋白尾數(shù)量增多，并形成MNGC，而bopA敲除的菌株則沒有發(fā)生明顯的變化，且胞內(nèi)細菌數(shù)量少。2.7bopA基因缺失對類鼻疽桿菌的小鼠肝臟、脾臟以及肺載菌量的影響對分別腹腔注射BPC006和BP(ΔbopA)小鼠進行觀察，注射BPC006的小鼠在第3天出現(xiàn)毛皮蓬亂、精神萎靡現(xiàn)象，而感染BP(ΔbopA)細菌的小鼠則未出現(xiàn)明顯的癥狀。通過小鼠肝臟、脾臟以及肺

盧曉雪等:類鼻疽伯克霍爾德菌bopA基因敲除株的構(gòu)建及生物學特征241Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn圖7細菌感染后細胞共聚焦圖片F(xiàn)igure7ConfocalmicrographswithDICimagesofRAW264.7cellsinfectedwithbopAknockoutstrainandwild-typestrain注：綠色：細胞骨架；藍色：細胞核；紅色：類鼻疽桿菌；白色箭頭：肌動蛋白尾；紅色箭頭：MNGC.Note:Green:F-actin;Blue:Nucleus;Red:BP;Whitearrow:Actintails;Redarrow:MNGC.自噬水平的重要標志，而SQSTM1蛋白則是檢測自噬流是否通暢的重要標志。一般情況下，自噬激活，MAP1LC3B表達量增加，同時LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高，自噬體與溶酶體融合，SQSTM1隨之被降解；反之則SQSTM1積蓄。已有研究表明，類鼻疽桿菌能夠圖8小鼠不同臟器載菌量Figure8BacterialcountofbopAknockoutstrainandwild-typestrainindiffentorgansofmiceNote:*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001.影響自噬體與溶酶體融合過程[9]，為了研究bopA基因缺失對類鼻疽桿菌感染后細胞自噬的影響，檢測了不同菌株感染后自噬相關(guān)蛋白的表達情況(圖9)。結(jié)果顯示BPC006和BP(ΔbopA)都能夠激活自噬(MAP1LC3B-Ⅱ明顯增加)，但不同于BPC006能夠通過抑制自噬流逃逸宿主免疫，BP(ΔbopA)感染后細胞SQSTM1蛋白明顯減少，自噬流通暢，與Rapa激活細胞自噬結(jié)果相同。圖9bopA敲除對BP感染后細胞自噬相關(guān)蛋白表達的影響Figure9EffectofBPbopAgeneonautophagyrelatedproteinexpression
【參考文獻】

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本文編號：2860542