【摘要】： 從1982年幽門螺桿菌(Helicobater pylori，H.pylori，Hp)發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，人們對(duì)Hp的認(rèn)識(shí)日漸深入。研究表明Hp是世界上感染率最高的細(xì)菌之一，是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要致病因子，也與胃癌和胃粘膜相關(guān)樣淋巴組織淋巴瘤(MALT)有一定的關(guān)系。1994年，世界衛(wèi)生組織正式將Hp列為人類的Ⅰ類致癌劑(Group Ⅰ carcinogen)，美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心也將Hp感染性疾病列為近年新出現(xiàn)的傳染病。 Hp的感染是個(gè)全球性的問(wèn)題。在發(fā)達(dá)國(guó)家，50％的成年人感染該菌；在發(fā)展中國(guó)家，幾乎80-100％的成年人感染該菌，兒童感染的比例也很高。50％以上的感染者胃部可發(fā)生不同程度的慢性炎癥；10～15％可發(fā)生消化性潰瘍；極少數(shù)可發(fā)生胃部惡性腫瘤。目前對(duì)Hp的診斷及藥物治療效果并不理想，存在價(jià)格昂貴，副作用大，不易被病人接受等局限。疫苗接種是預(yù)防和控制Hp感染的有效方法，而一種理想疫苗的研制成功關(guān)鍵在于有效保護(hù)性抗原的確定。 鞭毛是Hp定植及感染持續(xù)存在的重要條件之一。除參與Hp在局部定植及感染延續(xù)外，鞭毛還誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子分泌及增強(qiáng)Hp感染部位的炎癥反應(yīng)。有實(shí)驗(yàn)表明fla基因是所有Hp共同具有的基因且十分保守，其編碼的鞭毛蛋白，不僅對(duì)Hp的致病機(jī)制是十分必要的，且具有免疫原性和免疫反應(yīng)性。鑒于Hp感染的普遍性，以及鞭毛基因的特點(diǎn)，克隆和表達(dá)fal基因，對(duì)構(gòu)建Hp fla基因工程疫苗和從根本上防止Hp的感染有重要意義。作者采用基因克隆技術(shù)，將來(lái)自一臨床分離Hp MEL-HP27的fla(flaA1533bp、flaB1545bp)基因全長(zhǎng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并與克隆載體pNEB193進(jìn)行連接，制備重組質(zhì)粒，然后導(dǎo)入大腸桿菌TB1中，用藍(lán)白實(shí)驗(yàn)初步篩選可疑陽(yáng)性克隆。可疑陽(yáng)性克隆進(jìn)一步進(jìn)行特異PCR和酶切鑒定后對(duì)插入片斷進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)定的序列與已知序列進(jìn)行同源性比較。由于flaA編碼主要的鞭毛蛋白，所以將測(cè)序鑒 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 幽門螺桿菌鞭毛基因的克隆和表達(dá) 定后的.加刁基因插入表達(dá)載體pMAL一CZx中，所得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌TBI， 篩選陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR、酶切鑒定后，用異丙基一日一D一硫代半乳糖昔(IPTG)誘導(dǎo)其編碼 的蛋白表達(dá)，用SDS一PAGE、Westem一blot的方法鑒定表達(dá)產(chǎn)物及其免疫反應(yīng)性。 方法 1刀aA基因、刀“刀基因的克隆:通過(guò)PCR擴(kuò)增刀剛基因、加B基因，PcR產(chǎn)物 雙酶切，使之產(chǎn)生粘性末端，然后在T4DNA連接酶的作用下定向連接到質(zhì)粒pNEB193 上的多克隆位點(diǎn)，并使之轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TBI，通過(guò)藍(lán)白實(shí)驗(yàn)挑選可疑陽(yáng)性克隆，然后 進(jìn)行特異PCR和酶切鑒定，陽(yáng)性克隆命名為pNFA和pNFB。 2測(cè)序及分析對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒中插入的目的基因(刀刻、刀。刀)進(jìn)行測(cè)序，并與 報(bào)道的已知序列進(jìn)行同源性比較。 3重組表達(dá)載體的構(gòu)建將測(cè)序鑒定后的目的片段.刀剛基因從pNFA陽(yáng)性克隆中 純化、回收，與表達(dá)載體pMAL一CZx連接，并使之轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TBI，通過(guò)藍(lán)白實(shí)驗(yàn) 挑選可疑陽(yáng)性克隆，然后進(jìn)行特異PCR和酶切鑒定，陽(yáng)性克隆命名為pMFA。 4融合蛋白的表達(dá)和鑒定陽(yáng)性重組克隆PMFA用IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌TBI中 表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白為MBP一FLA，命名為MFA。采用10%的SDS一PAGE檢測(cè)融 合蛋白的表達(dá)情況，然后以鼠的Hp全菌抗體血清和人的Hp陽(yáng)性血清為一抗、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗人的IgG為二抗，用Westem blot檢測(cè)刀酬融合蛋白的免疫反應(yīng) 性。 結(jié)果 1幽門螺桿菌刀酬基因、刀“刀基因的克隆刀朗基因、加B基因經(jīng)PCR擴(kuò)增 后，電泳均產(chǎn)生約1 .skb的目的條帶。分別對(duì)目的片段和質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物 純化、回收后再連接、轉(zhuǎn)化、藍(lán)白篩選，挑選可疑陽(yáng)性克隆提取重組質(zhì)粒，單酶切電 泳后可見(jiàn)約4.2kb的條帶，然后進(jìn)行特異PCR和雙酶切鑒定，特異PCR產(chǎn)生約1 .skb 的條帶，雙酶切產(chǎn)生約2.7kb和1.skb的兩條帶，與預(yù)期結(jié)果相同，說(shuō)明重組質(zhì)粒的 制備是成功的。 2刀aA、刀口丑核昔酸序列分析對(duì)刀剛基因、刀。刀基因測(cè)序后與已知序列進(jìn)行 同源性比較，刀刻基因同源性為96.74%一97.39%，刀口刀基因同源性為96.38ry0~ 97.09%，其編碼的氨基酸序列的同源性分別為98.12~98.63%、95.04一98.26%，驗(yàn) 證了鞭毛基因的保守性。 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文幽門螺桿菌鞭毛基因的克隆和表達(dá) 3融合蛋白的表達(dá)將測(cè)序鑒定后的刀比談基因與表達(dá)載體pMAL一CZx連接，挑 選陽(yáng)性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS一PAGE顯示含重組質(zhì)粒的大腸桿菌TBI能表達(dá)出約95kDa的 融和蛋白，其中含有53kDa的FlaA蛋白和42.skDa的標(biāo)簽蛋白(MBP)，與預(yù)期分子 量大小相似。不同濃度的工PTG均能誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，經(jīng)薄層凝膠光密度掃描測(cè) 定其含量為16一25%;表達(dá)量以誘導(dǎo)后3h最高，占細(xì)菌總蛋白的28.5%。37℃誘導(dǎo) 時(shí)，融合蛋白主要以包涵體的形式存在于菌體超聲破碎物離心后的沉淀中，其量約占 細(xì)菌總蛋白的50%左右;35℃誘導(dǎo)時(shí)，融合蛋白存在于菌體超聲破碎物離心后的上清 和沉淀中，含量分別為28.42%、34.28%。 4融合蛋白免疫性檢測(cè)westem blot結(jié)果證實(shí)FlaA融合蛋白能與Hp口服免疫 小鼠的血清和HP感染的人的血清結(jié)合，一方面驗(yàn)證了表達(dá)產(chǎn)物的正確性，另一方面 證明了
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R346
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
論文 幽門螺桿菌鞭毛基因的克隆和表達(dá)
    前言
    材料與方法
    結(jié)果與分析
    討論
    小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
綜述
中英文縮略詞
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2855014