目的：探討tTG在肝細胞損傷和增生中的表達和分布規(guī)律，揭示tTG的雙重作用機制，豐富信號轉導方面的研究內容，為肝臟疾病的防治提供新的理論依據。 方法：以大鼠原代肝細胞為材料，給低濃度乙醇制造肝細胞損傷模型。同時另設防治組分別給PNLP、Putr、CsA，檢測其對乙醇引起的肝細胞損傷的影響。在倒置顯微鏡下觀察不同處理組細胞的生長情況；通過MTT比色法檢測肝細胞增殖活性；用Hoechst熒光染色法觀察細胞凋亡現象；運用免疫細胞化學法測定不同處理組細胞的tTG的陽性表達率；運用Western blot分析方法檢測tTG在細胞內不同部位的分布情況。 結果：1．MTT比色顯示：用200mM濃度的乙醇處理大鼠原代肝細胞24h后，細胞群增殖活性明顯受抑制，與正常對照組比較統(tǒng)計學上有顯著性差異(P＜0.01)，而PNLP(200uM)，Putr(100uM)，CsA(10uM)可使細胞群增殖活性回升，尤在PNLP組及CsA組細胞增生活躍，與乙醇組比較統(tǒng)計學上有顯著性差異(P＜0.01)。2．Hoechst熒光染色檢測細胞凋亡計數結果：在50mM乙醇處理18h后大鼠肝細胞已有較多凋亡細胞可進行形態(tài)學觀察，其凋亡細胞率分別為乙醇組15.4％，PNLP(200uM)組9.3％，Putr(100uM)組5.4％，CsA(10uM)組4.6％，正常對照組2.9％。乙醇組顯著高于其余各組(均有統(tǒng)計學意義，P＜0.01或P＜0.05)。3．tTG免疫細胞化學圖像分析：用50mM濃度乙醇處理大鼠肝細胞18h后，tTG蛋白表達已有顯著增高，各組積分光密度不同，乙醇組97.632，PNLP(200uM)組103.87，與正常對照組(64.557)相比 延邊大學醫(yī)學院碩士學位論文 顯著增高(均有統(tǒng)計學意義，P0.01);而Putr(100uM)組54.595，CsA(10田隨) 組40‘464，與乙醉組相比顯著降低(均有統(tǒng)計學意義，P0.01)。4.細胞質蛋白 中tTG的W七stem blot分析:各種處理分別同時作用于大鼠肝細胞18h后提取細 胞質蛋白進行檢測，其tTG的PAGE電泳條帶的平均光密度測量值分別為正常 組0.81，乙醇(50mM)組0.90，PNLP(200uM)組0.84，Putr(lmM)組0.66， CsA(3uM)組0.77，CsA(suM)組0.75。乙醇組明顯高于其余各組(除與PN毛P 組比較無統(tǒng)計學差異外，與其余各組比較統(tǒng)計學上均有顯著性差異，P0.01或 P0.05)，且CsA組顯示一定的負性劑量依賴關系。5.細胞核蛋白中tTG的 W七stem blot分析:各種處理分別同時作用于大鼠肝細胞18h后提取細胞核蛋白 進行檢測，測量其tTG的PAGE蛋白電泳條帶的平均光密度值結果不同，乙醇 (50mM)組為1 .02，高于正常對照組的0.9(統(tǒng)計學比較有顯著性差異，P0.05); 而Putr(l mM)組為0 .74，顯著低于乙醇組(統(tǒng)計學比較有顯著性差異，P0.01)。 6.細胞膜蛋白中tTG的W七stem blot分析:各種處理分別同時作用于大鼠肝細 胞18h后提取細胞膜蛋白進行檢測，其tTG的PAGE蛋白電泳條帶的平均光密 度值分別為正常對照組a25，乙醇(100血M)組0.19，乙醇加PNLP (100n1M+200uM)組0.32，PNIP(ZO0uM)組0.33。乙醇加PNLP組明顯高 于乙醇組及正常對照組(統(tǒng)計學上有顯著性差異，P0.01或P0.05);乙醇組顯 著低于正常對照組(統(tǒng)計學上有顯著性差異，P005)。 結論:1.CsA可抑制乙醇引起的細胞質tTG的高表達及細胞凋亡的發(fā)生， 促進肝細胞增生，提示tTG參與細胞凋亡的機制與線粒體及細胞色素C密切相 關;2.乙醇引起的 tTG在細胞質中的高表達可使其本身向細胞核內轉位，應用 Putr可抑制tTG向核內轉位，從而減少細胞損傷:3.PN毛P可引起細胞增生及細 胞膜tTG的高表達，tTG的膜分布可抑制其在細胞質及細胞核中時引起的對細 胞的損傷作用，這可能與在有限表達量的范圍內tTG的大量膜轉移減少了細胞 質游離的tTG含量，從而降低tTG向核內轉位有關;4.tTG的雙重生物學活性 主要是通過在細胞內向不同部位的轉移來發(fā)揮其不同活性和調節(jié)作用，促進細 胞凋亡的發(fā)生或參與細胞增生。
【學位單位】：延邊大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

而用tTG交聯活性抑制劑Putr與乙醇同時作用于細胞后，核內tTG的含量反而下降，與正常組相比下降達17.8%，與乙醇組相比下降達27.5%(統(tǒng)計學上有顯著性差異，P<001)。(圖16，圖17)圖16圖17:不同處理引起的細胞核蛋白中t勺G含量的變化Figl7.Alte段donoftTGeontantineeUularnuclearOroteinatthediffe代ntt代atl”e爪

6.肝細胞膜蛋白中“G的westernblot肝細胞膜蛋白中tTG的隊GE蛋白條帶的平均常對照組0.25，乙醇組0.19，乙醇加PNLP組0.32，原代肝細胞18h后，tTG在膜蛋白中的含量明顯降低，相比統(tǒng)計學上有顯著的差異，P<0.05)，PNLP與乙用于細胞后細胞膜內分布的tTG含量顯著增高，增%、73.7%(統(tǒng)計學比較有顯著性差異，P<0.01)，28%、32%(統(tǒng)計學上有顯著性差異，P<0.05或P<0.圖18
【參考文獻】

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本文編號：2852633