目的根據(jù)已知線性泛素化底物NF-κB必需調(diào)節(jié)蛋白(NEMO)的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域UBAN構(gòu)建蛋白探針,在目的細(xì)胞中富集線性泛素化底物并應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定,探索線性泛素化在不同生物學(xué)事件中發(fā)揮調(diào)控功能的分子機(jī)制。方法 (1)首先通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化特異性識(shí)別線性泛素鏈的蛋白UBAN,通過谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽將其與GST瓊脂糖微珠連接制成UBAN探針。隨后在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染陽性底物NEMO和線性泛素化鏈組裝復(fù)合體(LUBAC)使之過表達(dá),利用UBAN探針免疫共沉淀富集NEMO上的線性泛素鏈,并通過Western蛋白印跡法驗(yàn)證UBAN探針與線性泛素化鏈的結(jié)合能力,從而確定體系是否建立成功。(2)在293T細(xì)胞裂解液中免疫共沉淀富集線性泛素化底物并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析,得到潛在線性泛素化底物。在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染潛在線性泛素化底物極光激酶A(Aurora-A)和LUBAC,用Western蛋白印跡法鑒定。(3)用siRNA干擾Hela細(xì)胞LUBAC,并使細(xì)胞周期同步化,用Western蛋白印跡法觀察線性泛素化對(duì)潛在底物Aurora-A生物學(xué)功能的調(diào)控。結(jié)果 (1) Western蛋白印跡法結(jié)果表明,UBAN探針能夠結(jié)合NEMO上的線性泛素鏈,從而確定體系建立成功。(2)質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示,免疫共沉淀法富集到包括極光激酶A(Aurora-A)在內(nèi)的403個(gè)潛在線性泛素化底物;在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染Aurora-A和LUBAC后,用Western蛋白印跡法測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),Aurora-A具有線性泛素鏈特征性條帶,具有與線性泛素化鏈結(jié)合的能力。(3) Western蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,干涉LUBAC后Aurora-A蘇氨酸288位磷酸化水平上調(diào),表明其被激活。結(jié)論運(yùn)用泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域UBAN探針可以實(shí)現(xiàn)線性泛素化底物的有效捕捉與富集,在293T細(xì)胞中鑒定到底物Aurora-A的自激活可能受線性泛素化調(diào)控。本研究建立的線性泛素化底物鑒定策略為進(jìn)一步探索蛋白質(zhì)線性泛素化修飾的更多生物學(xué)功能提供了新的思路和方法。
【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 細(xì)胞、試劑和儀器
    1.2 M1-SUB探針制備
    1.3 M1-SUB探針中GST-UBAN蛋白含量測(cè)定
    1.4 M1-SUB探針功能驗(yàn)證
    1.5 用M1-SUB探針免疫共沉淀富集線性泛素化底物
    1.6 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定潛在線性泛素化底物
    1.7 潛在線性泛素化底物生物功能分析
    1.8 Western蛋白印跡法驗(yàn)證Aurora-A與線性泛素鏈結(jié)合活性
    1.9 Western蛋白印跡法檢測(cè)Aurora-A功能
2 結(jié)果
    2.1 M1-SUB探針中GST-UBAN蛋白的含量
    2.2 M1-SUB域探針與線性泛素鏈的結(jié)合能力
    2.3 用M1-SUB探針富集的潛在線性泛素化底物及其生物功能
    2.4 潛在底物Aurora-A與線性泛素鏈的結(jié)合活性
    2.5 線性泛素化對(duì)Aurora-A功能的影響
3 討論

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