目的：人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV) 感染人的皮膚和粘膜上皮細(xì)胞，與上皮細(xì)胞的良性與惡性增生密切相關(guān)。HPV的一些亞型可以引起皮膚疣、尖銳濕疣等良性增生性病變；而另一些亞型可以引起宮頸癌及其它生殖器腫瘤、皮膚腫瘤、口腔腫瘤等。由于缺乏特異的有效治療手段，HPV感染嚴(yán)重影響人類的健康，因此急需研制安全有效的疫苗。HPV目前尚不能在體外大量培養(yǎng)，難以研制傳統(tǒng)疫苗�；蛞呙缇哂兄苽浜唵�、免疫應(yīng)答持久、安全穩(wěn)定、可反復(fù)使用等優(yōu)點，是一種有前途的新型疫苗。HPV16的早期蛋白基因E7基因是基因疫苗的理想靶抗原，研究表明HPV16 E7疫苗可以誘導(dǎo)動物產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，保護小鼠不受HPV16陽性腫瘤細(xì)胞的攻擊，并且能抑制已經(jīng)形成的腫瘤的生長甚至使腫瘤消退。但是當(dāng)該疫苗應(yīng)用于靈長目動物時，其免疫原性降低；在人體中應(yīng)用該疫苗，其誘發(fā)的免疫應(yīng)答更為減弱。而疫苗最終要應(yīng)用于人體，因此必須進(jìn)一步提高疫苗的免疫原性。研究發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞因子基因與基因疫苗共同注射，可以提高基因疫苗的免疫效果。白細(xì)胞介素-15(Interleukin-15, IL-15)為一種最近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，可以共享白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2, IL-2)的受體和活性，例如：激活T細(xì)胞，特別是CD8+CTLs。除 WP=4 了具有IL-2活性外，它還在NK細(xì)胞的活化和其功能的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。IL-15基因已經(jīng)在一些實驗中被用作基因疫苗佐劑，取得了良好的促進(jìn)抗原特異性免疫應(yīng)答的效果。但是還沒有它對HPV16 E7基因疫苗免疫效果影響的報道，因此本實驗亞克隆了IL-15基因，構(gòu)建了其真核表達(dá)質(zhì)粒，與HPV16 E7基因疫苗共同注射于BALB/c小鼠，并觀察其對小鼠的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響。 方法：用EcoRI、BamHI雙酶切pGEM-T-IL-15質(zhì)粒，以Sliver Beads膠回收試劑盒酶回收500bp酶切產(chǎn)物IL-15，與同樣經(jīng)EcoRI、BamHI雙酶切的pcDNA3.1在DNA連接酶的作用下連接，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-15。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH-5α，于LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，小量提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI、BamHI雙酶切鑒定連接產(chǎn)物，選擇陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒大量提取并純化，測OD260和OD280進(jìn)行定量和純度檢測。pcDNA3.1-E7、pcDNA3.1同樣經(jīng)轉(zhuǎn)化、小量提取、雙酶切鑒定、大量提取、純化和定量。各種質(zhì)粒用生理鹽水(normal saline, N.S.) 稀釋至所需濃度，用于動物免疫。雌性BALB/c小鼠，6周齡，隨機分為6組，分別肌肉注射接種N.S.、pcDNA3.1、pcDNA3.1-E7、pcDNA3.1-E7+pcDNA3.1、pcDNA3.1-E7+pcDNA3.1-IL-15和pcDNA3.1-IL-15。每只100ug，混合接種組每種質(zhì)粒各100ug。接種前以25%高滲蔗糖溶液100ul預(yù)處理接種部位。2周后以同樣劑量加強免疫，共加強免疫3次。末次免疫1周后取血并分離血清，雙抗夾心ELISA法測定IFN-γ；無菌取脾，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔含5×105個脾細(xì)胞，并分別加入E7蛋白和RPMI1640+10% WP=5 滅活小牛血清，MTT法做T淋巴細(xì)胞增殖實驗，以O(shè)D570值之差代表T淋巴細(xì)胞增殖程度。組間比較采用單因素方差分析，顯著性檢驗水準(zhǔn)α=0.01。 結(jié)果: 構(gòu)建的pcDNA3.1-IL-15重組質(zhì)粒經(jīng)酶切得到500bp的基因片段，與pGEM-T-IL-15酶切得到的基因片段大小相等；pcDNA3.1-E7重組質(zhì)粒經(jīng)酶切得到300bp的基因片段與目的基因片段理論值大小相等。經(jīng)pcDNA3.1-E7免疫小鼠的血清中可以檢測到IFN-γ濃度為150.4pg/ml，而生理鹽水組和空質(zhì)粒組均未檢測到IFN-γ。pcDNA3.1-IL-15與 pcDNA3.1-E7共同注射，可以提高免疫小鼠血清中IFN-γ水平至414.1pg/ml，與E7+空質(zhì)粒組、E7組比較差異有顯著性(P0.01)。IL-15組沒有檢測到IFN-γ。經(jīng)pcDNA3.1-E7免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞出現(xiàn)了特異性T細(xì)胞增殖反應(yīng)，OD570差值為0.644，生理鹽水組和空質(zhì)粒組分別為0.228、0.322，E7組與生理鹽水組和空質(zhì)粒組之間差異均有顯著性(P0.01)。pcDNA3.1-IL-15與 pcDNA3.1-E7共同注射，可以增強特異性T細(xì)胞增殖反應(yīng)，OD570差值為1.313，與其他各組比較差異均有顯著性(P0.01)。 結(jié)論：1 本研究成功地構(gòu)建了人白細(xì)胞介素15基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-15。2 用pcDNA3.1-E7免疫小鼠可以誘導(dǎo)小鼠特異性T淋巴細(xì)胞的增殖，血清中可以檢測到IFN-γ。說明pcDNA3.1-E7具有免疫原性，可以誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答。3將pcDNA3.1-IL-15與pcDNA3.1- E7共同注射于BALB/c小鼠，可以增強小鼠特異性T淋巴細(xì)胞的增殖，并且血清中IFN-γ水平提高。pcDNA3.1-IL-15可以提高HPV16 E7基因疫苗免疫原性，增強小鼠細(xì)胞特異性 WP=6 免疫應(yīng)答。IL-15基因是一種優(yōu)良的HPV16 E7基因疫苗的基因佐劑。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
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英文摘要
研究論文 IL-15表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合HPV基因疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的實驗研究
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附圖
    附表
    參考文獻(xiàn)
綜述
致謝
個人簡歷

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

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本文編號：2847328