白細胞介素－2（IL-2）最初曾為稱為T細胞生長因子，并能促使各種造血細胞增殖和分化。臨床研究表明其關(guān)鍵作用可作為T淋巴細胞激活的增殖信號，因而將IL-2用于治療艾滋病。基于其能刺激具有細胞毒的，抗腫瘤細胞的能力，IL-2還用于各種癌癥的治療。目前人IL-2已經(jīng)完全用基因工程的方法生產(chǎn)，而且基因工程IL-2與天然IL-2的功能和臨床效果基本一致。 目的：近年來，雖然基因工程IL-2應(yīng)用于肝炎及某些癌癥的治療已取得令人屬目的成果，但大計量，長時間用藥對病人仍然存在一定的副作用，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、惡心、嘔吐、頭暈、乏力和毛細血管滲漏綜合癥等，所以，為了提高人重組白細胞介素－2的穩(wěn)定性和活性以及減少毒副作用，有必要定向改造rhIL－2的分子結(jié)構(gòu)，并在畢赤酵母中高效表達hIL-2cDNA，獲得hIL-2蛋白，擬對野生型hIL-2進行結(jié)構(gòu)改造以獲得新的突變體，同時進行活性測定，以便深入了解hIL-2的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。方法：用PCR法從白細胞介素-2cDNA全序列中擴增成熟的肽基因片段，并利用定點突變技術(shù)將人重組白細胞介素－2第125位游離的半胱氨酸編碼序列突變?yōu)楸彼嵝蛄校痪幋a18位亮氨酸的序列突變?yōu)榈鞍彼嵝蛄�；編碼19位亮氨酸的序列突變?yōu)榻z氨酸序列，經(jīng)限制酶片段分析與DNA序列分析證明后，獲得突變體MvhIL-2。IL-2基因片段與酵母中間載體pPIC9K融合后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10F',擴增質(zhì)粒，獲得大量pPIC9K-MvhIL-2DNA后，再轉(zhuǎn)化畢赤酵母，并在搖瓶和發(fā)酵罐上對IL-2-C125A/L18M/L19S進行了表達。然后，利用離子交換層析的方法純化了MvhIL-2蛋白，利用IL-2依賴細胞株CTLL－2細胞對純化的突變蛋白（IL-2-C125A/L18M/L19S）和野生型IL-2（同樣方法獲得的）進行測活。結(jié)果：本實驗成功地構(gòu)建IL-2突變體，并在畢赤酵母中得到表達。將pPIC9K-MvhIL-2DNA用酶切后，轉(zhuǎn)入真核表達系統(tǒng)－畢赤酵母得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)搖瓶和發(fā)酵罐發(fā)酵，上清液用15％SDS-PAGE檢測表明有IL-2突變體的表達；經(jīng)Western-blot和ELISA檢測有免疫活性。經(jīng)超濾濃縮，強陰離子交換Q柱層析得到純化的突變型人IL-2。純化的突變蛋白對CTLL-2細胞有刺激性；與野生型IL-2相比，在各種溫度條件下儲存的突變蛋白保留有更高的活性；pPIC9KMvhIL-2整合到畢赤酵母中表達量占菌體總蛋白的30％以上，高表達得到的IL-2具有高活性。結(jié)論人IL-2cDNA可通過PCR技術(shù)進行定點突變，所獲得的突變型MvhIL-2活性比天然型MvhIL-2高4－5倍。所以IL-2突變體（IL-2-C125A/L18M/L18S）較野 WP=5 生型的IL-2具有更高的穩(wěn)定性和活性。
【學(xué)位單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
1 緒論
    1.1 引言
    1.2 基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程
    1.3 本文的主要研究內(nèi)容
        1.3.1 國內(nèi)外研究概況及開發(fā)突變型IL-2的必要性
        1.3.2 人IL-2的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)
        1.3.3 IL-2R及其基因結(jié)構(gòu)
        1.3.4 IL-2生物學(xué)活性與IL-2R的相互關(guān)系
    1.4 本文的創(chuàng)新之處
        1.4.1 IL-2三突變位點的設(shè)計思想
        1.4.2 用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)（Pichia Pastoris）表達IL-2和變異IL-2
        1.4.3 建立一種簡單方便、且有效的Pichia Pastoris的直接誘導(dǎo)表達方法
        1.4.4 建立一套用Pichia Pastoris分泌表達的變異IL-2并利于工業(yè)化生產(chǎn)的純化工藝
2 克隆、表達及其純化
    2.1 材料與方法
        2.1.1 細胞株與質(zhì)粒
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 突變型白細胞介素-2工程菌發(fā)酵
        2.1.4. ①工程菌搖瓶條件下的發(fā)酵
        2.1.4. ②轉(zhuǎn)化子的高密度發(fā)酵
        2.1.5 突變型白細胞介素－2的純化
        2.1.6 突變型白細胞介素-2（IL-2）蛋白的抗原性檢測
        2.1.7 突變型白細胞介素-2生物活性的測定
        2.1.7 白細胞介素-2蛋的ELISA（免疫酶標技術(shù)）檢測
3 結(jié)果
    3.1 工程菌搖瓶條件下的發(fā)酵
        3.1.1 直接誘導(dǎo)法和轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基誘導(dǎo)法表達蛋白的結(jié)果
        3.1.2 碳源對轉(zhuǎn)化子生長的影響
        3.1.3 溫度對突變型IL-2表達的影響
        3.1.5 搖瓶轉(zhuǎn)速對突變型IL-2表達的影響
600對突變型白細胞介素－2蛋白表達的影響'>        3.1.6 不同OD₆₀₀對突變型白細胞介素－2蛋白表達的影響
    3.2 轉(zhuǎn)化子的高密度發(fā)酵
    3.3 突變型白細胞介素－2的純化
    3.4 突變型白細胞介素－2蛋白抗原性檢測
    3.5 MTT法活性測定的結(jié)果
4 討論
    4.1 較直接誘導(dǎo)法和傳統(tǒng)誘導(dǎo)法的比較
    4.2 畢赤酵母分泌型發(fā)酵產(chǎn)物純化和大腸桿菌包涵體產(chǎn)物的純化的比較
    4.3 野生型IL－2蛋白同突變IL－2蛋白的性質(zhì)比較
5 結(jié)論
參考文獻
致謝
附錄：攻碩期間論文發(fā)表及參加科研項目情況

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 虞建良,范佩芳,鄭宏大,孫蘭英,王子軒,鄭仲承,李伯良,陳寅,唐建偉,劉新垣;人白細胞介素-2在大腸桿菌高效表達及其純化與鑒定[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1995年10期

2 蔣春雷,徐荻,周月芳,鄭仲承,劉新垣,宋朝佑,路長林;人白細胞介素-2結(jié)構(gòu)與鎮(zhèn)痛功能關(guān)系的研究[J];中國科學(xué)C輯:生命科學(xué);1996年01期

3 唐建偉,劉愛萍,虞建良,范佩芳,劉新垣;兩種新型白細胞介素-2的熱穩(wěn)定優(yōu)越性[J];生物工程學(xué)報;1996年04期

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本文編號：2847194