樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是一種專職抗原遞呈細(xì)胞，能啟動(dòng)初始T細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，在免疫系統(tǒng)中居于獨(dú)特的地位。DC是異質(zhì)性細(xì)胞群體，具有不同亞群及不同功能狀態(tài)。成熟DC有很強(qiáng)的免疫激活作用，可啟動(dòng)初始免疫應(yīng)答；非成熟DC則顯示出較強(qiáng)的致耐受活性，但這種致耐受活性通常隨DC成熟而轉(zhuǎn)變成免疫原性。目前研究表明，促進(jìn)DC的成熟與功能，在抗腫瘤及抗感染治療方面意義重大；而抑制DC的成熟，對(duì)于在移植排斥反應(yīng)和自身免疫病中誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞耐受具有重要意義。所以，有關(guān)DC發(fā)育成熟的調(diào)控因素與機(jī)制研究，已成為當(dāng)今免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。 α-黑素細(xì)胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)是一種具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能的神經(jīng)肽，通過(guò)MC1R～MC5R五型受體介導(dǎo)其生物活性。近期研究發(fā)現(xiàn)，在人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的樹突狀細(xì)胞(monocyte-derived dendritic cell，MoDC)上表達(dá)有α-MSH受體MC1R。α-MSH能下調(diào)MoDC的CD86、CD40表達(dá)，提示α-MSH可能對(duì)DC的成熟和功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。而已知腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及新近發(fā)現(xiàn)的表達(dá)于髓系細(xì)胞的激發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)都可促進(jìn)DC前體發(fā)育成熟。 基于上述研究，本課題進(jìn)一步研究了α-MSH對(duì)TNF-α或激活TREM-1誘導(dǎo)的MoDC成熟是否有調(diào)節(jié)作用，以及相關(guān)的機(jī)制如何。 第一部分 α-黑素細(xì)胞刺激素對(duì)人單核細(xì)胞來(lái)源的樹突狀細(xì)胞成熟的調(diào)節(jié)作用 取健康獻(xiàn)血者的白細(xì)胞，用本室已建立的方法從中分離得到單核細(xì)胞，聯(lián) 第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 合使用GM一CSF及IL4誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為MoDC。將培養(yǎng)的MODC分為不 同處理組:僅使用GM一CSF及IL4誘導(dǎo)分化的MoDC;加用TNF一�；蚣�(dòng)性 TREM一1抗體刺激的MoDC(TNF一Q處理的MoDC或TREM一1抗體處理的 MoDC);加入a一MSH作用于MoDC(a一MSH處理的MoDC);在每次加TNF一a 或TREM一1抗體Zh前，加入(:一MSH作用于MoDC(a一MSH+TNF一a處理的 MoDC或a一MSH+TREM一1抗體處理的MoDC)。收獲培養(yǎng)第8天的各組MoDC 進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn):(1)觀察細(xì)胞形態(tài)差異;(2) FACS檢測(cè)細(xì)胞表型和細(xì)胞攝取 抗原的能力;(3)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)MoDC刺激同種異體T細(xì)胞增殖的 能力;(4)檢測(cè)MoDC的抗原遞呈能力;(5) ELISA檢測(cè)MoDC產(chǎn)生IL12 的水平。 結(jié)果表明:TNF一a處理的MODC具有成熟DC的特征，與其相比，a一MSH +TNF一Q處理的MoDC樹突不夠明顯，呈單核細(xì)胞狀;表面分子CD86、MHC H、CDla及CD83降低;攝取抗原的能力較強(qiáng);刺激同種異基因淋巴細(xì)胞增 殖的能力較弱;向同基因T細(xì)胞提呈抗原并刺激其增殖的能力也較弱;分泌 正12降低。說(shuō)明Q一MSH可抑制TN下一a誘導(dǎo)的MODC成熟。 TREM一1激動(dòng)性抗體處理的MODC具有成熟DC的特征，與其相比，a一MSH +TREM一1抗體處理的MoDC樹突不夠明顯，表面分子CD86、MHC 11、CDla 及CD83表達(dá)下降，提示TREM一1介導(dǎo)的MoDC成熟可被。一MSH抑制。用FACS 檢測(cè)了MoDC表達(dá)TREM一1的情況，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3天與7天的MoDC表達(dá)TREM一1 均較低;將培養(yǎng)7天的DC用廿S刺激24h后，TREM一1表達(dá)明顯升高。將培 養(yǎng)7天的Q一MSH處理的MoDC用LPS刺激24h后，TREM一1表達(dá)與僅用廿S 刺激相比，上調(diào)幅度減小。表明。一MSH可抑制廿S刺激DC引起的TREM一1 上調(diào)。 第二部分。一黑素細(xì)胞刺激素調(diào)節(jié)人單核細(xì)胞來(lái)源的 樹突狀細(xì)胞成熟的機(jī)制初探 為了探討Q一MSH抑制TNF一a誘導(dǎo)MODC成熟的機(jī)制，本部分實(shí)驗(yàn)中，首 第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 先取TNF一Q處理的MODC與。一MSH+TNF一Q處理的MODC進(jìn)行全蛋白雙向電 泳圖譜分析，發(fā)現(xiàn)兩者間產(chǎn)生差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)37個(gè)。然后對(duì)Q一MSH+TNF一a 處理的MoDC表達(dá)明顯上調(diào)的3個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛 行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定，得到膚質(zhì)量指紋圖譜。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析，確定 這3個(gè)蛋白質(zhì)分別為膜聯(lián)蛋白I(Annexinl)、維甲酸受體相關(guān)的孤兒受體一a (retinoid acid reeeptor一relatedo甲han reeeptor一alpha)、胃癌多藥抗性蛋白突變體 (gastrie caneer multi一drug resistanee protein variant)。進(jìn)一步用Western一Blot方 法檢測(cè)了Annexinl的表達(dá)水平，證實(shí)了Annexin工在Q一MSH+TNF一Q處理的 MODC中表達(dá)升高。提示a一MSH抑制TNF一Q誘導(dǎo)MoDC成熟與膜聯(lián)蛋白I、 維甲酸受體相關(guān)的孤兒受體、胃癌多藥抗性蛋白突變體表達(dá)上調(diào)有關(guān)。 已知NF一KB轉(zhuǎn)錄因子在DC的成熟過(guò)程中起到重要作用，。一MSH可抑制 不同炎性因子對(duì)某些細(xì)胞NF一KB的激活。為了探討Q一MSH抑制TNF一a誘導(dǎo)的 MoDC成熟，是否也涉及對(duì)NF一KB激活的抑制，故進(jìn)行了EMSA檢測(cè)，結(jié)果 表明:與TNF，a處理的MoDC相比，Q一MSH+TNF一a處理的MODC核蛋白抽 提物中NF一KB與DNA結(jié)合下降，說(shuō)明Q一MSH可抑制MODC中NF一KB與DNA 的結(jié)合。 本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Q一MSH對(duì)TNF一Q或TREM一1激動(dòng)性抗體誘導(dǎo)的MoDC成 熟具有抑制作用，其機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)的膜聯(lián)蛋白I、維甲酸受體相關(guān)的孤兒受體、 胃癌多藥抗性蛋白突變體表達(dá)上調(diào)以及NF一KB與DNA結(jié)合降低有關(guān)。本研究 為闡明DC成熟的調(diào)控機(jī)制，以及進(jìn)一步研究以DC為靶標(biāo)的措施用于防治
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖1一1不同處理的MoDC形態(tài)(x400)ChangesofMoDCmorphologyindifferenttreatmentF一a一treatedMoDC;B:a一MSH+1，NF一a一trti一TREM小treatedMoDC;D:a一MSH+anti一TREM

在抗原提呈功能實(shí)驗(yàn)中，MoDC和T細(xì)胞均來(lái)自同一獻(xiàn)血者，兩種細(xì)胞的MHC一n類分子相同，起作用的僅僅是MoDC提呈的抗原分子，因此這一實(shí)驗(yàn)體現(xiàn)了MoDC的抗原處理、加工和提呈的綜合功能。從圖1一5可以看出，與TNF一a處理的MoDC相比，a.MSH十TNF一a處理的MoDC抗原遞呈功能較低。

2.2MALD卜ToF一MS質(zhì)譜分析及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)同源性分析對(duì)2一DE凝膠上表達(dá)明顯上調(diào)的3個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行切割，用胰蛋白酶消化后，進(jìn)行MA工DLTOF一MS檢測(cè)，得到膚質(zhì)量指紋圖譜，如圖2一2、2一3以及2一4所示。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，結(jié)合2一DE圖譜上相應(yīng)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、PI值，確定這3個(gè)蛋白質(zhì)分別為spotl:膜聯(lián)蛋白I(八刀nexinl)、sPotZ:維甲酸受體相關(guān)的孤兒受體a(retinoidaeidreeeptor-relatedo印hanreeeptor一alpha，RORa)、spot3:胃癌多藥抗性蛋白突變體(gastrieeaneermulti一drugresistaneeProteinvariant)。表2一1通過(guò)2一DE及M泊工Dl一TOF一MS分析。一MSH+TNF一Q處理的MoDC與TNF一a處理的MoDC之間表達(dá)差異的蛋白質(zhì)TableZ一1DifferentiallyexPressedMoDCProteinsbetweena一MSH+TNF~a一treatedMoDCandINF一a一treatedMoDC，isolatedandidentifiedbyZ一DEandMALDI一TOF一MSanalysisSPotProteinName材卜/PIIntensityMatchedNo.(%)Allnexinl38714.5/6
【參考文獻(xiàn)】

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1 劉和春,楊春,楊青,張維冰,張玉奎;毛細(xì)管等電聚焦/毛細(xì)管無(wú)膠篩分電泳二維蛋白質(zhì)分離平臺(tái)的構(gòu)建[J];分析化學(xué);2004年03期

2 何威;陳愛(ài)華;宋旭東;;地爾硫?抑制酶修飾低密度脂蛋白對(duì)外周血中樹突狀細(xì)胞分化成熟的影響研究[J];中國(guó)藥房;2009年13期

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1 沈娟;α-黑素細(xì)胞刺激素在實(shí)驗(yàn)性心臟移植中的作用及其機(jī)制[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2003年

本文編號(hào)：2845687