目的建立檢測犬腎細(xì)胞(madin-darby canine kidney, MDCK)宿主細(xì)胞蛋白(host cell protein, HCP)含量的雙抗體夾心ELISA。方法從MDCK細(xì)胞中提取細(xì)胞總蛋白,免疫新西蘭兔制備兔抗MDCK細(xì)胞蛋白多克隆抗體,抗體經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀和Protein A層析純化后,采用SDS-PAGE分析抗體純度,Western blot檢測抗體特異性。用純化的多克隆抗體作為包被抗體,并采用改良過碘酸鈉標(biāo)記法制備酶標(biāo)抗體,建立ELISA并確定包被抗體濃度和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體稀釋度等最適條件。確定該方法較佳的線性范圍及檢測限,并對該法特異性、準(zhǔn)確度、精密性和重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證。最后,用該方法分別對接種流感病毒的MDCK細(xì)胞上清收獲液和純化樣品進(jìn)行MDCK細(xì)胞蛋白含量檢測,初步驗(yàn)證其在純化工藝開發(fā)中的適用性。結(jié)果通過免疫新西蘭兔制備了高滴度的兔抗MDCK細(xì)胞蛋白多克隆抗體血清,滴度可達(dá)1∶8 000。純化后的兔抗MDCK細(xì)胞蛋白多克隆抗體純度90%,并可與MDCK細(xì)胞蛋白特異性結(jié)合。建立的雙抗體夾心ELISA的理想包被抗體質(zhì)量濃度為10μg/mL,酶標(biāo)抗體的工作濃度為1∶500稀釋。該方法的線性范圍為50～2 500 ng/mL,檢測限為50 ng/mL;該方法對Vero細(xì)胞、293T細(xì)胞和Mrc-5細(xì)胞等其他細(xì)胞HCP無交叉反應(yīng),特異性良好;不同濃度的MDCK細(xì)胞HCP回收率在98.5%～111.9%之間,變異系數(shù)均10%。接種流感病毒的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)多步純化后MDCK細(xì)胞蛋白質(zhì)量濃度逐漸降低至900 ng/mL,純化工藝可有效去除MDCK細(xì)胞蛋白殘留。結(jié)論建立雙抗體夾心ELISA檢測MDCK細(xì)胞殘余HCP含量的方法,可用于基于MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗下游工藝開發(fā)中宿主細(xì)胞殘留HCP含量監(jiān)測。
【部分圖文】：

7］，分別利用12%SDS-PAGE和Westernblot分析抗體純度及特異性。通過Lowry法測定抗體濃度并根據(jù)HＲP-抗體標(biāo)記試劑盒說明書要求進(jìn)行抗體標(biāo)記。1．6雙抗體夾心ELISA的建立用純化的兔抗體作為包被抗體，5%人血白蛋白為封閉液，HＲP標(biāo)記羊抗兔抗體作為二抗，建立雙抗體夾心ELISA基本方法，進(jìn)一步研究不同包被抗體質(zhì)量濃度(5、10、20和40μg/mL)、二抗的工作濃度(1∶500、1∶1000、1∶2000和1∶4000)等條件下的HCP濃度和A450nm值的相關(guān)性，按照圖1操作，以確定適宜的工作條件。圖1雙抗體夾心ELISA檢測方法流程圖Fig．1TheflowchartfordoubleantibodysandwichELISAdetection1．7方法的驗(yàn)證1．7．1線性范圍將MDCK細(xì)胞蛋白抗原參考品作系列稀釋至50～2500ng/mL，用建立的雙抗體夾心ELISA進(jìn)行檢測，進(jìn)行3次重復(fù)，以MDCK細(xì)胞HCP質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，A450nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍與檢測限。1．7．2特異性驗(yàn)證按照MDCK細(xì)胞HCP制備方法來制備Vero細(xì)胞、293T細(xì)胞和Mrc-5細(xì)胞HCP，用建立的雙抗體夾心ELISA檢測并分析此方法的特異性。1．7．3準(zhǔn)確度、精密性與重復(fù)性驗(yàn)證將MDCK細(xì)胞HCP抗原參考品分別稀釋至1000、500和250ng/mL，用建立的雙抗體夾心ELISA在不同的時間重復(fù)測定8～10次，計(jì)算檢測回收率及變異系數(shù)，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度與重復(fù)性。1．8方法在基于MDCK培養(yǎng)的流感疫苗純化工藝中的適用性收集甲型H7N9流感病毒接種MDCK細(xì)胞后的細(xì)胞上清收獲液和經(jīng)澄清、超濾、兩步層析后進(jìn)一步超濾透

氖視瞇?收集甲型H7N9流感病毒接種MDCK細(xì)胞后的細(xì)胞上清收獲液和經(jīng)澄清、超濾、兩步層析后進(jìn)一步超濾透析的樣品，用建立的方法檢測純化過程中HCP含量的變化。1．9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用Excel2010軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫，并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。用SPSS16．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(x珋±SD)表示，對重復(fù)性檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和LSD檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2．1MDCK細(xì)胞蛋白抗原及參考品制備制備的3批MDCK細(xì)胞蛋白電泳分析見圖2，蛋白質(zhì)量濃度為1μg/mL。稀釋分裝保存，用于后續(xù)新西蘭兔的免疫，同時作為HCP參考品，參考品質(zhì)量濃度為0．2μg/mL。注:M．Marker;1～3．制備的3批MDCK細(xì)胞蛋白。圖2制備的MDCK細(xì)胞HCPSDS-PAGE分析Fig．2AnalysisoftotalproteinextractspreparedfromMDCKcellbySDS-PAGE微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展2019年8月第47卷第4期ProginMicrobiolImmunol，Aug．2019，Vol．47No．4·3·

2．2MDCK細(xì)胞蛋白兔多克隆抗體制備、純化與標(biāo)記將MDCK細(xì)胞HCP輔以弗式完全佐劑和弗氏不完全佐劑免疫新西蘭兔后可誘導(dǎo)良好的抗體反應(yīng)，且隨著免疫次數(shù)的增加兔血清抗體滴度呈增長趨勢，經(jīng)4次加強(qiáng)免疫后，兔血清抗體滴度可達(dá)到1∶8000，見圖3。圖3新西蘭兔經(jīng)不同次數(shù)免疫后針對MDCK細(xì)胞蛋白的血清抗體反應(yīng)情況Fig．3ＲabbitantibodyresponsesagainstMDCKcellproteininimmunizationprocess血清抗體經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法和ProteinA親和層析后，利用SDS-PAGE分析，其純度可達(dá)到95%，見圖4。進(jìn)一步利用Westernblot分析，顯示純注:M．Marker;1．純化兔抗MDCK細(xì)胞HCP抗體還原SDS-PAGE;2．純化兔抗MDCK細(xì)胞HCP抗體非還原SDS-PAGE。圖4純化兔抗MDCK細(xì)胞HCP抗體SDS-PAGEFig．4AnalysisofpurifiedrabibitantibodiesagainstMDCKcellHCPbySDS-PAGE化的抗體可與MDCK細(xì)胞HCP特異性結(jié)合并具有較好的覆蓋率，見圖5。注:M．Marker;1．純化兔抗MDCK細(xì)胞HCP抗體。圖5純化兔抗MDCK細(xì)胞HCP抗體Westernblot分析Fig．5AnalysisofpurifiedrabibitantibodiesagainstMDCKcellHCPbyWesternblot2．3雙抗體夾心ELISA的建立2．3．1包板抗體濃度確定結(jié)果顯示，在包板質(zhì)量濃度為10μg/mL時，HCP質(zhì)量濃度和A450nm值有較高的線性相關(guān)性，Ｒ2=0．9940，見圖6。2．3．2檢測抗體稀釋度確定結(jié)果顯示，HＲP標(biāo)記抗體的稀釋度為1∶500時標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，Ｒ2=0．9908，因此將1∶500確定為HＲP標(biāo)記抗體最佳工作濃度，見圖7。2．4方法的驗(yàn)證2．4?
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