發(fā)布時(shí)間：2020-10-15 05:37

　　 酪氨酸蛋白激酶(Protein Tyrosine Kinase，PTK)是存在細(xì)胞膜或細(xì)胞漿中的蛋白激酶，它具有典型的羧基端催化區(qū)，當(dāng)被激活后可以將其底物以及自身的酪氨酸殘基磷酸化。Doks(downstream of tyrosine kinase)是一類新近發(fā)現(xiàn)的存在于胞漿中的與酪氨酸激酶相關(guān)的信號(hào)分子，可以作為PTK直接底物分子而被磷酸化；含有多個(gè)與其它分子相互作用的信號(hào)域或氨基酸基序，具有典型的細(xì)胞內(nèi)分子接頭特征。 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是一種新型神經(jīng)營養(yǎng)因子，屬于TGF-β超家族成員，1993年由Lin等首先從大鼠B49細(xì)胞系的上清中分離純化得到的。GDNF的神經(jīng)營養(yǎng)作用主要是通過兩類受體亞基介導(dǎo)，即膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體alpha(GFRas)亞基和受體酪氨酸激酶RET(rearranged during transfection)亞基。2001年Grimm等人利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)了Dok5分子與c-Ret在多種神經(jīng)組織中共表達(dá)，作為其底物而介導(dǎo)PC12細(xì)胞的突起生長，相對(duì)于Dok1而言Dok5不與RasGAP和Nck相互作用，卻能增強(qiáng)c-Ret依賴性的MAPK激活，因此，Dok5分子在GDNF對(duì)多巴胺能神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元、交感神經(jīng)元等多種神經(jīng)元促進(jìn)分化、存活和損傷保護(hù)作用中可能發(fā)揮重要的作用。 本研究采用基因真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)來分析Dok5分子在GDNF誘導(dǎo)PC12-GFRal-RET細(xì)胞分化中的作用。首先克隆并成功構(gòu)建pEYFP-N1-Dok5真核表達(dá)質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染已經(jīng)建立的基因工程細(xì)胞，進(jìn)行定位分析；然后進(jìn)行分化測(cè)定，最后分析其促進(jìn)分化的機(jī)制。我們從表達(dá)定位、促分化作用以及作用機(jī)制三個(gè)角度對(duì)Dok5的功能進(jìn)行了初步研究。 研究主要內(nèi)容與結(jié)果如下： 一、pEYFP-N1-Dok5及pcDNA3.1(+)-Dok5真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建及在PC12-GFRa1-RET細(xì)胞中的定位。 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEYFP-N1-Dok5以及真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Dok5。采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將pEYFP-N1-Dok5轉(zhuǎn)入PC12-GFRal-RET細(xì)胞，在Olympus BX60熒光顯微鏡和Metamorph軟 中文摘要 件組成的圖像處理系統(tǒng)上進(jìn)行熒光觀察轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞，GDNF刺激下Doks轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞發(fā)出的熒光在周邊增強(qiáng)，而pEYFP一Nl轉(zhuǎn)染以及PcDNA3.1(+)- Doks與pEYFP一Nl共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則不明顯。 二、Doks對(duì)GDNF誘導(dǎo)的PC12一GFRal一RET細(xì)胞分化有促進(jìn)作用。 對(duì)照組pEYFP一Nl，實(shí)驗(yàn)組pEYFP一Nl一Doks、pEYFP一Nl一Dokl(實(shí)驗(yàn)室已 有)分別轉(zhuǎn)入 PC12一GFRal一RET細(xì)胞，GDNF作用4一5天，在Olympus BX6o 熒光顯微鏡和Metamorph軟件組成的圖像處理系統(tǒng)上進(jìn)行熒光觀察熒光細(xì)胞 并計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pEYFP一Nl一Doks組具有明顯的促進(jìn)分化作用，而pEYFP- Nl一Dokl組具有明顯的抑制分化作用。 以pEYFP一Nl與peDNA3.1共轉(zhuǎn)染作為空白對(duì)照組，pEYFP一Nl與Doks- pcDNA3.1共轉(zhuǎn)染作為實(shí)驗(yàn)組，以同樣方法處理細(xì)胞，結(jié)果依舊提示Doks促進(jìn) GDNF誘導(dǎo)的PC12一GFRal一RET細(xì)胞的分化。 三、分析Doks促進(jìn)GDNF引起的PC12一GFRal一RET細(xì)胞分化作用的機(jī) 制。 按照上述轉(zhuǎn)染方法，在轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入MEK抑制劑 PD，PI3K抑制劑LY以及Src抑制劑PP:各15分鐘，再加入GDNF培養(yǎng)4一5 天，再以上述的方法觀察和計(jì)數(shù)，結(jié)果表明抑制作用如下:PPZPDLY，三組 與GDNF組均有差別，提示，Doks非特異的通過PI3K，MEK一MAPK以及Sre 介導(dǎo)的分化通路促進(jìn)GDNF誘導(dǎo)的PC12一GFRal一RET細(xì)胞分化。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，受體酪氨酸激酶底物分子Deks能通過PI3K，MEK- MAPK，Src通路非特異的促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)PC12一GFRal- RET細(xì)胞的分化。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
1 前言
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
3 結(jié)果
1-Dok5的獲得'>    3.1 pEYFP-N₁-Dok5的獲得
    3.2 pcDNA3.1（+）-Dok5的獲得
    3.3 Dok5在PC12-GFRal-RET細(xì)胞中的表達(dá)及定位
    3.4 Dok5促進(jìn)GDNF誘導(dǎo)的PC12-GFRal-RET細(xì)胞的分化
    3.5 Dok5促進(jìn)GDNF誘導(dǎo)的PC12-GFRal-RET細(xì)胞分化的機(jī)制
4 討論
    4.1 DOK5的克隆，表達(dá)以及定位
    4.2 Dok5促進(jìn)GDNF誘導(dǎo)PC12-GFRal-RET細(xì)胞分化作用
    4.3 Dok5促進(jìn)GDNF誘導(dǎo)的PC12-GFRal-RET細(xì)胞分化的機(jī)制
5 結(jié)論
附錄
參考文獻(xiàn)
致謝
文獻(xiàn)綜述

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本文編號(hào)：2841776