目的:斑馬魚作為一種重要的脊椎動物,憑借體型小、生命周期短和繁殖量大等特點被廣泛應用于多種疾病模型的研究。斑馬魚受精后48 h,中性粒細胞即發(fā)揮作用;72 h至3 w的斑馬魚幼魚階段處于只有固有免疫的特殊時期。斑馬魚免疫系統(tǒng)的發(fā)育與成熟過程與人類極為相似,且基因組與人類高度同源,成魚既有固有免疫又有適應性免疫,是研究機體病原生物感染后免疫應答很好的模式生物。為研究沙門菌質粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence genes,spv)對機體感染與免疫的影響,本研究用鼠傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar typhimurium,S.typhimurium,STM)野生株STM-WT和缺失spv基因的突變株STM-Δspv,第一部分用受精后72 h只有固有免疫的斑馬魚幼魚模型,探討該基因對機體感染與固有免疫功能的影響;第二部分建立8月齡具有適應性免疫的成魚感染模型,探討spv基因對機體感染及Th1/Th2免疫應答的影響,為進一步闡明沙門菌質粒毒力基因spv的致病機制和對機體免疫功能的影響提供理論和實驗依據(jù)。方法:1.沙門菌質粒毒力基因spv對幼魚感染及固有免疫功能的影響(1)沙門菌在斑馬魚幼魚體內(nèi)的播散斑馬魚感染按本實驗室已建立的幼魚感染模型方法進行,用紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)標記的鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT和突變株STM-Δspv,浸染受精后72 h(hours post-fertilization,hpf)的斑馬魚幼魚,為STM-WT組和STM-Δspv組,每組30條,感染后2、4和8 h分別取10條用熒光顯微鏡觀察細菌在體內(nèi)的播散情況。(2)沙門菌質粒毒力基因spv對中性粒細胞募集的影響用鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT和突變株STM-Δspv感染72 hpf斑馬魚幼魚,以上兩感染組每組30條,另設對照組10條魚,收集對照組和感染后2、4和8h各10條斑馬魚,固定后用可對中性粒細胞顆粒進行著色的蘇丹黑染色,顯微鏡觀察中性粒細胞募集情況。(3)沙門菌質粒毒力基因spv對巨噬細胞吞噬功能的影響設對照組、STM-WT和STM-Δspv感染后2、4和8 h組,每組10條,在72 hpf斑馬魚培養(yǎng)液中加入中性紅染液,根據(jù)感染后巨噬細胞吞噬染料程度判斷細胞功能。于不同時間點加入鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT和突變株STM-Δspv使其分別浸染2、4和8h,將幼魚麻醉后置顯微鏡下觀察巨噬細胞著色情況。(4)沙門菌質粒毒力基因spv對巨噬細胞吞噬后細菌存活的影響用鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT和突變株STM-Δspv感染72 hpf幼魚,每感染組40條魚,另設對照組10條,收集對照組及感染后2、4、8和12h各10條斑馬魚,分離巨噬細胞后進行胞內(nèi)菌落計數(shù)(colony-forming unit,CFU)。2.沙門菌質粒毒力基因spv對成魚感染及Th1/Th2免疫應答的影響(1)沙門菌-斑馬魚成魚感染模型的建立用103、104、105、106和107 CFU鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT口飼感染8月齡的成魚,每組10條,觀察各劑量下對成魚的存活及感染情況,繪制3周生存率曲線。用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time Quantitative PCR,q PCR)檢測肝臟Th1型細胞特異性T-box家族的新型轉錄因子(T-box factor expressed in T-cells,T-bet,亦稱TBX21)基因tbx21和Th2細胞特異性的轉錄因子GATA結合蛋白3(GATA binding protein3,GATA-3)基因gata3 m RNA轉錄水平;Th1型細胞因子γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、白介素12(interleukin-12,IL-12)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因IFN-γ、IL-12和TNF-α以及Th2型細胞因子IL-4、IL-10和IL-13基因IL-4、IL-10和IL-13的m RNA轉錄水平,計算Th2/Th1相對表達量比值并確定用于后續(xù)實驗的合適感染菌量。(2)沙門菌質粒毒力基因spv對斑馬魚成魚感染的影響用上述條件建立的成魚感染模型,設對照組、STM-WT和STM-Δspv組,以105 CFU STM-WT和STM-Δspv口飼后1 d、7 d和14 d,每時間點取5條魚,解剖取出肝臟和腸道。分別進行CFU、蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色)后光鏡下觀察和透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察腸道超微結構變化。(3)沙門菌質粒毒力基因spv對Th1/Th2免疫應答的影響設對照組、STM-WT和STM-Δspv組,用STM-WT和STM-Δspv口飼后7 d、14 d,每時間點取5條魚,取出斑馬魚肝臟和腸道,提取組織RNA,q PCR檢測tbx21、gata3以及Th1型細胞因子基因IFN-γ、IL-12和TNF-α,Th2型細胞因子基因IL-4、IL-10和IL-13的m RNA轉錄水平,為顯示Th1/Th2免疫偏移,計算gata3/tbx21和IL-4/IFN-γ的相對表達量比值。同時用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測Th1型細胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α,Th2型細胞因子IL-4、IL-10和IL-13的含量。結果:1.沙門菌質粒毒力基因spv對幼魚感染及固有免疫功能的影響(1)沙門菌在斑馬魚幼魚體內(nèi)的播散:熒光顯微鏡下觀察結果顯示,感染后2 h兩組斑馬魚體內(nèi)均有少量帶有紅色熒光的細菌播散,組間未見差異;感染后4 h紅色熒光標記的野生株STM-WT組(RFP-STM-WT)頭部及卵黃囊部位有較明顯的紅色點狀聚集,而突變株STM-Δspv組(RFP-STM-Δspv)只有少量紅色點狀;感染后8 h RFP-STM-WT組口周出現(xiàn)大量的紅色細菌聚集。(2)沙門菌質粒毒力基因spv對中性粒細胞募集的影響感染前未見中性粒細胞聚集的黑色顆粒;感染后隨著時間的延長,黑色顆粒增多;感染后4 h和8 h STM-Δspv組的黑色顆粒均顯著多于STM-WT組(P0.05)。(3)沙門菌質粒毒力基因spv對巨噬細胞吞噬功能的影響感染前未見明顯的紅色點狀聚集;從感染后2 h到8 h,可見越來越多的紅色點狀聚集;感染后2、4和8 h三個時間點STM-WT組紅色點狀聚集均少于STM-Δspv組,感染后8 h最為顯著(P0.05)。(4)沙門菌質粒毒力基因spv對巨噬細胞內(nèi)菌落計數(shù)的影響胞內(nèi)CFU計數(shù)結果顯示,菌量隨著感染時間的延長遞增,感染后4h、8 h和12 h STM-WT組CFU均顯著高于STM-Δspv組(P0.05)。2.沙門菌質粒毒力基因spv對成魚感染及Th1/Th2免疫應答的影響(1)沙門菌-斑馬魚成魚感染模型的建立用105 CFU感染2周后斑馬魚全部存活,第15天開始出現(xiàn)死亡,在3周后死亡率達50%;感染后3周解剖發(fā)現(xiàn),肝臟、脾臟和腸道有明顯紅腫和糜爛;肝臟Th1和Th2型細胞相關基因和細胞因子m RNA轉錄水平明顯向Th2偏移。(2)沙門菌質粒毒力基因spv對成魚感染的影響臟器組織CFU結果顯示,隨著感染時間增加,肝臟和腸道細菌量均增多,但STM-WT組均顯著高于STM-Δspv組(P0.05)。肝臟HE染色見隨感染時間增加,STM-WT組肝臟有大量空泡變性,且局部有炎性細胞浸潤;STM-Δspv組感染后1d和7 d肝臟組織未見空泡變性,感染后14 d出現(xiàn)空泡變性,但少有炎性細胞浸潤。腸組織HE染色見STM-WT組中隨時間增加腸壁變薄,腸上皮微絨毛排列不整,并有炎性細胞浸潤。STM-Δspv組在感染后1 d和7 d腸壁厚度未見明顯改變,微絨毛排列較整齊,感染后14 d出現(xiàn)輕微紊亂。透射電鏡下見未感染的斑馬魚對照組,腸上皮排列整齊,細胞界限清晰,游離面有緊密整齊的微絨毛;STM-WT組感染后1 d可見腸道微絨毛斷裂,上皮細胞形態(tài)未見明顯改變;感染后7 d細胞界限模糊,腸腔和細胞內(nèi)均見有細菌分布;STM-Δspv組感染后1 d與對照組無明顯差別,感染后7 d微絨毛有輕微斷裂,細胞結構也有改變。(3)沙門菌質粒毒力基因spv對Th1/Th2免疫應答的影響:q PCR檢測結果顯示STM-WT組感染后14 d,肝臟和腸道中gata3/tbx21和IL-4/IFN-γ的相對表達比值均顯著上升(P0.05);在感染后14 d,STM-WT組IL-12和TNF-α的表達水平顯著低于STM-Δspv組,IL-10和IL-13的表達水平顯著高于STM-Δspv組(P0.05)。ELISA檢測結果顯示,感染7 d和14 d后,肝臟和腸道中STM-WT組IFN-γ含量均顯著低于STM-Δspv組(P0.05);感染后14 d,STM-WT組IL-12和TNF-α的含量顯著低于STM-Δspv組,IL-4和IL-10的含量STM-WT組顯著高于STM-Δspv組(P0.05);肝臟中IL-13的含量未見明顯差異,但在腸道中感染7 d和14 d后,STM-WT組均顯著高于STM-Δspv組(P0.05)。結論:1.沙門菌質粒毒力基因spv通過抑制中性粒細胞和巨噬細胞向炎癥部位的趨化、聚集及吞噬殺傷,利于病原菌逃逸機體的固有免疫反應,從而促進細菌在體內(nèi)的播散加重感染。2.構建的沙門菌-斑馬魚成魚感染模型,能反映機體感染和免疫功能的變化,可用于研究適應性免疫Th1/Th2免疫應答,為進一步研究鼠傷寒沙門菌感染與免疫機制提供了很好的實驗工具。3.沙門菌質粒毒力基因spv通過抑制Th1型細胞基因tbx21的轉錄和細胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α的表達,促進Th2型細胞基因gata3的轉錄和細胞因子IL-4、IL-10和IL-13的表達,使Th1/Th2發(fā)生免疫偏移,增強細菌毒力從而加重感染。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R378.22
【文章目錄】：
中文提要
Abstract
引言
第一部分 沙門菌質粒毒力基因spv對幼魚感染及固有免疫功能的影響
    1. 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
        1.3 統(tǒng)計學處理
    2. 結果
        2.1 沙門菌在斑馬魚幼魚體內(nèi)的播散
        2.2 沙門菌質粒毒力基因spv對中性粒細胞募集的影響
        2.3 沙門菌質粒毒力基因spv對巨噬細胞吞噬功能的影響
        2.4 沙門菌質粒毒力基因spv對巨噬細胞吞噬后細菌存活的影響
    3. 討論
第二部分 沙門菌質粒毒力基因spv對成魚感染及Th1/Th2免疫應答的影響
    1. 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
        1.3 統(tǒng)計學處理
    2. 結果
        2.1 沙門菌-斑馬魚成魚感染模型的建立
        2.2 沙門菌質粒毒力基因spv對斑馬魚成魚感染的影響
        2.3 沙門菌質粒毒力基因spv對Th1/Th2免疫應答的影響
    3. 討論
小結
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間本人出版或公開發(fā)表的論著、論文
本課題所獲的基金資助
英文縮略詞表
致謝

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本文編號：2841534