目的:通過研究miR-17-5p對(duì)自噬相關(guān)基因ATG7的靶向調(diào)控機(jī)制和對(duì)細(xì)胞自噬的作用,探究miR-17-5p在結(jié)核分枝桿菌介導(dǎo)的自噬途徑中的作用及其機(jī)制。方法:生物信息學(xué)分析得到miR17-5p的靶基因ATG7,通過成功構(gòu)建載體ATG7野生型(p Mir GLO-ATG7-3'UTR-WT)和突變型,利用雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)、Western blot驗(yàn)證miR-17-5p和ATG7的靶向關(guān)系,同時(shí)構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌(H37Ra)感染的人源性THP-1巨噬細(xì)胞模型,將做不同處理的細(xì)胞分為三組:miR-17-5p mimics、miR-17-5p inhibitor、miR-17-5p nc。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測(cè)H37Ra感染對(duì)miR-17-5p表達(dá)量的影響,并且進(jìn)一步通過Western blot、免疫熒光觀察檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá)量和自噬小體的數(shù)量。結(jié)果:MTB感染能夠引起miR-17-5p的下調(diào),隨著感染復(fù)數(shù)的增加有明顯的降低。而生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR-17-5p與ATG7具有靶向性,雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、Western blot驗(yàn)證miR-17-5p能夠和ATG7靶向結(jié)合,并對(duì)其進(jìn)行負(fù)調(diào)控。進(jìn)一步通過Western blot、免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)miR-17-5p mimics組LC3Ⅱ的表達(dá)下調(diào),自噬小體表達(dá)降低,而miR-17-5p inhibitor組相反。其中對(duì)H37Ra感染組與未感染組之間比較,ATG7和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。結(jié)論:miR-17-5p直接靶向結(jié)合ATG7 3'UTR抑制自噬,在巨噬細(xì)胞抗MTB過程中發(fā)揮作用。
【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化
        1.2.2 構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌感染的THP-1巨噬細(xì)胞模型
        1.2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染THP-1
        1.2.4 microRNA表達(dá)量的檢測(cè)
        1.2.5 miR-17-5p相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)
        1.2.6 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因
        1.2.7 載體構(gòu)建
        1.2.8 雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析
        1.2.9 ATG7和LC3蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)
        1.2.1 0 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞免疫熒光
    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 H37Ra感染THP-1細(xì)胞后miR-17-5p的表達(dá)情況
    2.2 載體構(gòu)建及測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證
    2.3 miR-17-5p對(duì)ATG7的靶向性驗(yàn)證
    2.4 miR-17-5p對(duì)自噬流及自噬小體形成的作用
3 討論

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