抗體在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中起著重要的作用，被廣泛地運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)室研究、疾病的診斷與治療。噬菌體抗體庫技術(shù)為人單抗的制備開創(chuàng)了一個(gè)全新的技術(shù)領(lǐng)域，它使用聚合酶鏈延伸反應(yīng)(PCR)方法，把免疫球蛋白全套可變區(qū)基因擴(kuò)增出來，重組到原核表達(dá)載體中，并通過與噬菌體外殼蛋白形成融合蛋白，使抗體片段表達(dá)于噬菌體表面，這樣可用類似親和層析的方法，篩選特異性的可變區(qū)基因。這樣就可以不經(jīng)過雜交瘤、甚至不經(jīng)過免疫就可獲得特異地結(jié)合不同抗原的抗體片段。本實(shí)驗(yàn)用PCR，從正常人外周血中分離淋巴細(xì)胞，克隆出抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因，重組到表達(dá)載體中，構(gòu)建了人源性噬菌體抗體庫。 一、抗體輕、重鏈基因的擴(kuò)增。這一部分主要包括以下步驟：①淋巴細(xì)胞的分離②總RNA的提取③mRNA的純化④反轉(zhuǎn)錄⑤PCR。結(jié)果：共提取出RNA 640μg；mRNA的純化后得到7.2μg。經(jīng)過RT-PCR，VH，VL及VK的每一條5’端引物與其相應(yīng)的3’端引物都成功地?cái)U(kuò)增出可變區(qū)基因片段。 第 四 軍 醫(yī) 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 二、載體酶切、連接、轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)士。較高的酶切效率、連接 及轉(zhuǎn)化效率，對于保證抗體庫的純度和容量的大小是十分重要 的。在這一部分中，主要就這一方面快一探討。對pDANS分別 用 Xho、Nhe、BssH 11并在不同緩沖條件下進(jìn)行酶切，其酶 切效率通過電轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行測定；人pDpNS載體上切下一小 片段，在連接回去，觀察載體與片段的連接效率；純質(zhì)粒及連接 體系中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的測定。結(jié)果：XllOI、Nllll、BSSH IJ的 酶切效率是非常高的，可以滿足均建抗體庫的要求。而 Sal的 酶切效率卻只有 50％左右。XI。O無論是在其最適緩沖液（H h肚r）還是在由低鹽緩沖液山，1加殃r）所矯正（每川…體系加 入 IPllM的 NaCI）的體系當(dāng)中都能夠取得較高的酶切效率；載 體與片段的連接效率為 2刁8 x 10s’pg載體，說明如果能夠保證 這些片段的兩端完全被限制性內(nèi)切酶聽消化，那么要構(gòu)建一個(gè)庫 容量為 10’的抗體庫，僅需十多次連接和一百多次轉(zhuǎn)化即可；純 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率一般可達(dá)到：IXIO＼5 XIO’轉(zhuǎn)化于；’pgDNA。連 接體系中質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率較純質(zhì)粒低，而T4DNA連接酶是影響 其轉(zhuǎn)化效率的主要因素。通過熱滅話將 T4 DNA連接酶滅活，或 者用酚、氯仿抽提后，體系中的＊＼人轉(zhuǎn)化問題基本可以得到解 決，能夠達(dá)到與單純質(zhì)粒相近的轉(zhuǎn)化效率。 三、PCR產(chǎn)物酶切及連接效率的改進(jìn)二PCR產(chǎn)物的克隆對于抗體 庫的構(gòu)建是十分重要的一步。但是，由于PCR產(chǎn)物的酶切效率很 低，致使片段兩端不能夠被完全切開，最終使得PCR產(chǎn)物的克隆 效率較低。這一部分就此問題進(jìn)行了探討。發(fā)現(xiàn)：①兩端完全切 開的片段與載體連接，每… l連接產(chǎn)物可以得到約 l叫．4 XIO’個(gè) 克隆，完全可以滿足抗體庫的要求。所以，關(guān)鍵問題就是如何能 第 四 軍 醫(yī) 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 夠得到兩端被完全消化的可變區(qū)基因片段：②P＊R產(chǎn)物直接酶切 效率很低，即使在酶切位點(diǎn)之外填加了長達(dá)36hp的保護(hù)序列，并 且把消化時(shí)間延長至12小時(shí)，結(jié)果也只有50％左右的片段被完 全消化切開。因此，增加保護(hù)序列的長度或者延長酶切的時(shí)間并 不能夠解決＊＊R產(chǎn)物難以酶切的難題：③同樣，P＊R產(chǎn)物經(jīng)過酶 切后直接與載體連接的效率很低；④而PCR產(chǎn)物與T載體連接 的效率較高，可滿足抗體庫的要求廠⑤將pSP73改造后制備成 丁載體。 四、人源性天然抗體庫的構(gòu)建。首先用前面闡述的T載體方法， 先將輕鏈、重鏈可變區(qū)基因片段分別克隆入PSp73＊中，構(gòu)建出 輕鏈庫和重鏈庫。然后，將輕鏈片段從PSp73＊上切出來，克隆 入pDANS中，再將重鏈片段從PSp73＊上切出來，并克隆入己 有輕鏈插入的pDANS中。這樣，經(jīng)過這兩步分步克隆，就構(gòu)建 出了人源性單鏈抗體庫。下一步，再經(jīng)過噬菌體挽救，就可以將 這一抗體庫呈現(xiàn)在噬菌體的表面了。 經(jīng)過以上四個(gè)部分，一個(gè)人源性單鏈抗體庫就建成了。今后， 應(yīng)用相應(yīng)的抗原物質(zhì)，可以對其進(jìn)行有目的的篩選，就可獲得具 有一定親和力的抗體c
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
英文縮寫
中文摘要
英文摘要
文獻(xiàn)回顧
前言
第一部分 抗體輕、重鏈基因的擴(kuò)增
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
第二部分 載體酶切、連接、轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
第三部分 PCR產(chǎn)物酶切及連接效率的改進(jìn)
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
第四部分 人源性天然抗體庫的構(gòu)建
    材料與方法
    結(jié)論
    討論
研究總結(jié)
致謝
參考文獻(xiàn)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2837084